穴位敏化的納米分子影像學(xué)研究進(jìn)展＊

曹 瑾，李昱頡，王 鑫，盧夢晗，楊利娟，牟秋杰，劉俊彤，趙江豪，姜 婧，李志剛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029）

穴位敏化的納米分子影像學(xué)研究進(jìn)展＊

曹 瑾，李昱頡，王 鑫，盧夢晗，楊利娟，牟秋杰，劉俊彤，趙江豪，姜 婧，李志剛＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029）

穴位敏化是穴位接受刺激因素后激發(fā)機(jī)體調(diào)節(jié)功能的動態(tài)過程。目前，運(yùn)用影像學(xué)技術(shù)的穴位敏化研究盡管已有一定的成果，但仍存在以下局限性：忽略了穴位敏化的時空動態(tài)性、忽略了敏化過程中特征性物質(zhì)的動態(tài)變化、特定分子探針尚未得到較好運(yùn)用。隨著分子影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不僅可以觀察到穴位敏化動態(tài)過程中的生物物理學(xué)變化，還可深入到細(xì)胞、分子水平的研究。同時，前沿納米技術(shù)和材料正愈發(fā)廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。將生物成像技術(shù)和納米生物技術(shù)的優(yōu)勢有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的納米生物成像技術(shù)，可為穴位敏化的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為探討穴位敏化的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

穴位 敏化 分子影像學(xué) 納米探針

隨著針灸在全球范圍內(nèi)的廣泛運(yùn)用和其他新興科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，針灸作用機(jī)理的現(xiàn)代化研究倍受關(guān)注。2015年中國針灸學(xué)會年會上也提出要“借助先進(jìn)科學(xué)方法技術(shù)深化針灸科學(xué)原理的研究，引領(lǐng)經(jīng)絡(luò)腧穴實(shí)質(zhì)與針灸作用機(jī)制的研究方向”，這為未來針灸學(xué)基礎(chǔ)研究指明了發(fā)展方向。

《靈樞·九針十二原》載：“機(jī)之動，不離其空”，空即指腧穴。腧穴與深層組織器官互聯(lián)互通，不僅是人體臟腑經(jīng)絡(luò)氣血輸注出入于體表的特殊部位，也是針灸作用和機(jī)理研究的部位?！缎♂樈狻丰屖貦C(jī)為守氣，《類經(jīng)》言其“察氣至之動靜也”?？梢姡蜓ㄊ求w現(xiàn)氣機(jī)變化的部位[1]?！鹅`樞·邪氣臟腑病形》言：“黃帝曰：刺之有道乎？岐伯答曰：刺此者，必中氣穴，無中肉節(jié)，中氣穴則針游于巷，中肉節(jié)即皮膚痛”。《靈樞·四時氣》載：“灸刺之道，得氣穴為定”。由此可見，中氣穴是針灸發(fā)揮治療作用的必要條件，其表現(xiàn)可視為穴位的敏化過程。

穴位敏化這一概念目前已得到學(xué)界的普遍認(rèn)可，即穴位功能活動是一個動態(tài)的過程，由生理性的“靜息”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇缘摹凹せ睢睜顟B(tài)，實(shí)現(xiàn)接收刺激及調(diào)節(jié)機(jī)體功能“開/合”的轉(zhuǎn)變，此動態(tài)過程即穴位的敏化，該過程是針灸發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)[2，3]。

現(xiàn)象是認(rèn)識本質(zhì)的向?qū)?，從穴位現(xiàn)象入手則是認(rèn)識穴位本質(zhì)與針灸作用原理的最佳向?qū)?。穴位的解剖結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征、理化微環(huán)境及其與內(nèi)臟的聯(lián)系等是穴位生物物理學(xué)特性的基礎(chǔ)，而穴位敏化則是穴位特性的直接反映[4]。目前，對穴位敏化現(xiàn)象的基礎(chǔ)性研究仍處于探索階段。以往運(yùn)用影像學(xué)手段的穴位敏化的客觀成像研究盡管有所收獲，但仍存在以下局限：針對穴位局部形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究多以靜態(tài)成像為主,而忽略了穴位敏化過程的時空動態(tài)性；細(xì)胞分子水平的顯像研究多以靜態(tài)顯微成像為主，而忽略了穴位敏化過程特征性細(xì)胞與物質(zhì)變化的動態(tài)特征；尚未運(yùn)用特定分子探針對穴位敏化過程中的關(guān)鍵物質(zhì)進(jìn)行活體動態(tài)的觀察等。隨著當(dāng)下影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這些局限正被逐步打破：借助生物功能成像技術(shù)、小動物活體成像技術(shù)及分子影像示蹤技術(shù)，可以在活體狀態(tài)下將穴位敏化的動態(tài)過程準(zhǔn)確、直觀地呈現(xiàn)出來，并對其過程中的關(guān)鍵物質(zhì)進(jìn)行示蹤成像。這些影像學(xué)技術(shù)不僅可以客觀顯示穴位敏化動態(tài)過程中的生物物理學(xué)變化，亦可使研究的層次深入至細(xì)胞、分子水平，為進(jìn)一步探討穴位敏化的物質(zhì)基礎(chǔ)提供客觀的科學(xué)依據(jù)。

1 納米分子影像學(xué)的應(yīng)用

1999年，分子影像學(xué)（Molecular Imaging，MI）一詞由美國哈佛大學(xué)的Ralph Welssleder教授提出，旨在通過圖像直觀顯示細(xì)胞和分子水平的生理、病理的動態(tài)監(jiān)測過程[5]。目前，分子影像學(xué)的主要成像技術(shù)包括單光子衍射成像技術(shù)（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT）、電子計算機(jī)X線斷層掃描（Computed Tomography，CT）、正電子發(fā)射斷層成像（Positron Emission Tomography，PET）、磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、光聲成像（Photoacoustic Imaging，PI）以及多模態(tài)成像，如：PET/CT、SPECT/CT、PET/MRI等[6-8]。分子影像學(xué)技術(shù)的三大要素為分子探針、信號放大和高靈敏探測儀。探針可與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合并發(fā)出影像學(xué)信號，其特征如下∶①能特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)而不產(chǎn)生明顯的副作用；②通透性強(qiáng),可順利通過生物屏障：如血管及細(xì)胞膜；③體內(nèi)狀態(tài)相對穩(wěn)定；④可在一定時間內(nèi)經(jīng)血液循環(huán)清除；⑤在與影像信號偶聯(lián)后，在成像過程中能夠放大被探信號進(jìn)而得到理想的檢測信息[9]。

隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，科學(xué)研究對分子影像成像分辨率的要求越來越高，前沿的納米技術(shù)和材料正愈發(fā)廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。較之分子探針，納米探針的靶向結(jié)合力更佳、影像信號強(qiáng)度更優(yōu)且代謝動力學(xué)可控性更強(qiáng)。由生物成像技術(shù)和納米生物技術(shù)交叉結(jié)合產(chǎn)生的納米生物成像技術(shù)，將它們各自的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行了有機(jī)的結(jié)合，為從細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)認(rèn)識穴位敏化過程奠定基礎(chǔ)。

1.1 納米CT

CT成像技術(shù)作為一種能夠在無損狀態(tài)下觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方法在醫(yī)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。由于傳統(tǒng)CT技術(shù)分辨率只有微米量級，因而無法進(jìn)行生物體體內(nèi)細(xì)胞水平的成像。目前，具有較高X射線吸收系數(shù)的含碘物質(zhì)常被用作CT造影劑[10]，但其弊端亦不可忽視：一方面含碘物質(zhì)造影時間較短并具有腎毒性，會在短時間內(nèi)被腎臟清除;另一方面X射線誘導(dǎo)電離反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)物碘離子亦具有毒性和更大的損害作用。新型的納米CT具有較高的空間分辨率和穿透性以及友好的成像環(huán)境和線性吸收等特點(diǎn)，為研究細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能活動提供了最先進(jìn)手段[11-13]。

目前納米生物技術(shù)正處于蓬勃發(fā)展的時期，納米CT探針特別是金納米顆粒的廣泛應(yīng)用愈發(fā)受到關(guān)注。金不僅有更強(qiáng)的X射線吸收能力，且具有更強(qiáng)的造影效果[14]。2006年,1.9 nm的金納米顆粒首次應(yīng)用于CT造影[15]，該成像可更為清晰地顯示腫瘤所在部位,甚至能從現(xiàn)象中辨出更精微的血管等結(jié)構(gòu)，同時造影時間也有所延長。相關(guān)實(shí)驗表明[16,17]，金納米探針在注射4 h后CT衰減值仍維持在較高水平，明顯優(yōu)于碘造影劑30-70 s的最佳成像時間，且產(chǎn)生相同效果所需的造影劑用量尚不及碘的10%。有研究證實(shí)[18]，基于金納米探針對X射線較好的吸收能力,可在一定程度減少腫瘤病患者CT掃描過程中的輻射量。

納米CT還可以在保持細(xì)胞活性的前提下觀察細(xì)胞內(nèi)部的超精細(xì)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行三維圖像重建，獲得細(xì)胞的內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)[19]，其分辨率可與電子顯微鏡結(jié)果相媲美[20]。此外，借助三維拼接算法還可得到多個細(xì)胞完整清晰的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)部細(xì)胞器的組織結(jié)構(gòu)信息。進(jìn)行三維渲染處理后可做成系列的旋轉(zhuǎn)或切片等三維渲染視頻，從而更加直觀地從三維動態(tài)圖像上觀察細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。隨著金納米的表面等離子震蕩（Localized Surface Plasmid Resonance，LSPR）特性[21,22]的深入開發(fā)和光學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，金納米微粒探針目前逐步發(fā)展成為一種有效的跟蹤和監(jiān)測細(xì)胞及其內(nèi)物質(zhì)的最新成像標(biāo)記物[23]，應(yīng)用于物理、化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的分析檢測，在分子影像學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。鑒于此，納米CT技術(shù)可應(yīng)用于穴位敏化肥大細(xì)胞脫顆粒這一細(xì)胞水平動態(tài)過程的研究。

1.2 納米PET與MRI

穴位敏化過程與高級神經(jīng)中樞功能活動之間存在著密切關(guān)系[24]。腦功能成像技術(shù)是近代神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大革命之一，其對腦功能的變化從腦血流、氧代謝、葡萄糖代謝、受體和神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)電生理變化等多層次、多水平進(jìn)行客觀成像研究[25]。這種功能成像方法有望揭示穴位敏化與中樞特定功能區(qū)或功能核團(tuán)之間在生理與病理上的聯(lián)系，為研究穴位敏化的中樞作用機(jī)制提供客觀的事實(shí)依據(jù)。目前最常用的腦功能成像技術(shù)有正電子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描技術(shù)（Positron Emission Computed Tomography，PET）與功能性磁共振成像技術(shù)（Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI）。

PET具有較高的靈敏度，鑒于其可定量并能由動物實(shí)驗結(jié)果推廣至臨床使用等諸多優(yōu)勢，已逐步發(fā)展成為一項成熟的分子影像學(xué)技術(shù)。當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的示蹤劑是18F-氟代脫氧葡萄糖，其實(shí)質(zhì)是糖代謝特異性顯像劑。PET在有關(guān)穴位敏化的研究中，主要是通過觀察生理或病理狀態(tài)下穴位敏化過程中大腦特定區(qū)域葡萄糖代謝的變化情況[26]。納米探針作為造影劑能得到更加清晰的影像結(jié)果，有利于科學(xué)研究和臨床診斷，主要在于其具有傳統(tǒng)分子探針無法比擬的多功能化特性[27,28]。

fMRI是指基于血氧水平依賴（Blood Oxygen Level Dependent，BOLD）的功能磁共振成像，它通過測量神經(jīng)活動引起的腦血流和腦血氧等成分的變化而造成的磁共振信號變化來反映腦功能活動[29,30]。

此外，金納米微粒示蹤技術(shù)也可應(yīng)用于穴位敏化的客觀成像研究中。肥大細(xì)胞脫顆粒后釋放的組織胺（HA）和五羥色胺（5-HT）是公認(rèn)的參與穴位敏化過程的關(guān)鍵物質(zhì)[31-35]，然而先前的研究主要是對二者進(jìn)行含量變化的靜態(tài)研究，尚缺乏對其動態(tài)的成像研究，而要對其分泌、釋放過程進(jìn)行動態(tài)觀察，則應(yīng)采用有效的活體分子影像示蹤手段[36]。對穴位敏化過程中二者動態(tài)、客觀的顯像在很大程度上依賴于分子影像探針的發(fā)展。靶向物質(zhì)與靶HA和5-HT結(jié)合的特異性和親和力是決定穴位敏化分子成像探針的首要因素，它必須從分子水平識別并特異性的結(jié)合HA和5-HT，進(jìn)而在穴位敏化局部呈現(xiàn)特異性顯影，從而客觀呈現(xiàn)穴位敏化局部關(guān)鍵物質(zhì)的動態(tài)變化。金納米材料（Gold Nanoparticles，GNPs）是最穩(wěn)定的貴金屬納米材料之一，金納米材料具有宏觀金粒子所不具備的物理性質(zhì)：其粒徑可控易合成，化學(xué)性質(zhì)活潑、生物相容性好，易修飾、吸附其他物質(zhì)，有特殊的光電性等。金納米材料有球形、星形、棒狀、殼狀等多種表現(xiàn)形式，在免疫檢測、細(xì)胞成像、光熱治療、放療增敏等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[37-39]。因此，在穴位敏化局部關(guān)鍵物質(zhì)的客觀成像研究中，利用金納米微粒探針在活體狀態(tài)下標(biāo)記肥大細(xì)胞釋放的HA與5-HT的動態(tài)變化，可為深入探討穴位敏化局部物質(zhì)基礎(chǔ)提供客觀的顯像依據(jù)。

1.3 納米光聲成像

以超聲技術(shù)和組織內(nèi)部光學(xué)吸收差異相結(jié)合光聲成像技術(shù)，可同時提供生物組織的光學(xué)吸收信息和聲學(xué)信息。其對比度強(qiáng)、空間分辨力高、成像過程無損，因而在結(jié)構(gòu)和功能成像方面應(yīng)用前景廣闊。納米探針可一定程度上地增強(qiáng)光聲成像的靈敏度，削減入射光在組織中發(fā)生強(qiáng)散射現(xiàn)象，因而使該技術(shù)不僅能夠應(yīng)用于組織的結(jié)構(gòu)成像，更可拓展至功能成像領(lǐng)域。

目前，多種光、聲學(xué)成像技術(shù)都應(yīng)用納米金顆粒作為對比增強(qiáng)劑。金納米顆粒的主要優(yōu)勢在于靶向肽和抗體可結(jié)合到其表面，不僅可作為細(xì)胞特異性對比劑進(jìn)行分子顯像，同時也能顯示更深層的組織信息[40]。Yang X等[41]研究顯示，運(yùn)用金納米棒能夠提高光聲學(xué)成像的診斷效果。Li P C等[42]通過偶聯(lián)有特定抗體的金納米棒使之具有腫瘤靶向性，將其作為探針能夠顯著增強(qiáng)光聲成像效果。Cai X等[43]發(fā)現(xiàn)新型納米材料金納米籠的光聲探針能夠很好地對淋巴結(jié)進(jìn)行顯像。Kim J W等[44]制備的包被金外層的碳納米管作為光聲成像探針，能夠同時發(fā)揮金、碳二者的優(yōu)勢，其成像信號是普通探針的數(shù)十倍。

1.4 多模態(tài)納米成像

每種影像學(xué)技術(shù)都有其自身的優(yōu)勢與短板。CT對高密度組織的分辨率較高,卻難以診斷空腔臟器的病變；PET具有靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),能夠提供病灶較為詳盡的功能與代謝等分子信息,但仍存在一定的假陽性和假陰性現(xiàn)象；MRI雖具有很強(qiáng)的組織穿透力,但其成像靈敏度較低；光學(xué)成像的優(yōu)勢在于具有發(fā)射光譜可調(diào)且成像時間短,但其自發(fā)熒光和組織穿透力差的不足突顯。單一的成像模式已無法滿足診斷的需求, 鑒于此，雙模甚至多模態(tài)的成像技術(shù)亟需發(fā)展。PET/CT雙模成像正是PET與CT的結(jié)合,但其作用卻大于單純的PET成像加CT成像。分子影像學(xué)將不再是一個單一的技術(shù)變革，而是多種技術(shù)的整合，多模成像發(fā)展的必要條件之一就是具有多功能性的探針的研究。

當(dāng)前納米影像學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)正是多功能納米探針的研發(fā)。Yang J等[45]以聚乙二醇-葡萄糖-金納米粒為探針做掃描的造影劑，micro-PET/CT顯示小鼠注射納米金粒子后腫瘤的輪廓更為清晰，位置更加確切；Alric C等[46]以釓螯合物包被的金納米探針在小鼠體內(nèi)進(jìn)行雙模式成像并獲得清晰的CT/MRI圖像；Kircher M F等[47]發(fā)現(xiàn)包覆多層功能化殼材料的金核結(jié)構(gòu)納米探針因自身的強(qiáng)光吸收能力而具有光聲成像的特性,而金核及其表面結(jié)合的拉曼染料則使該探針具備拉曼成像的功能,探針外修飾的Gd螯合物同時又具備磁共振成像功能。因此，該探針可在腦部腫瘤診療的各階段發(fā)揮不同優(yōu)勢：首先，MRI可在術(shù)前診斷中對病變部位進(jìn)行準(zhǔn)確的定位;隨后，光聲成像技術(shù)因其高空間分辨率可實(shí)時指導(dǎo)手術(shù)的進(jìn)行；而拉曼成像具有高靈敏度、高特異性，可對預(yù)后情況進(jìn)行監(jiān)測。

2 前景與展望

現(xiàn)有穴位敏化的影像學(xué)研究已經(jīng)運(yùn)用fMRI發(fā)現(xiàn)了合谷、內(nèi)關(guān)、神門、外關(guān)、足三里、太沖、三陰交在穴位敏化后對應(yīng)激活的相關(guān)腦區(qū)[48-59]，PET顯像發(fā)現(xiàn)外關(guān)、足三里等穴位敏化后可引起相應(yīng)腦區(qū)葡萄糖代謝的變化且針刺干預(yù)后亦可引起類似的變化[60,61]。上述結(jié)果進(jìn)一步說明，穴位敏化過程與中樞存在著一定的聯(lián)系，大腦可能是穴位敏化發(fā)揮效應(yīng)的調(diào)控中樞。

納米生物技術(shù)具有很大的發(fā)展?jié)摿?，將對醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深刻影響，而探針又無疑決定著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展方向。納米探針一定程度上避免了傳統(tǒng)分子探針存在的缺陷,在影像學(xué)研究領(lǐng)域取得了顯著成就；納米探針也逐漸從基礎(chǔ)研究領(lǐng)域走向臨床應(yīng)用。多種磁性納米探針已相繼應(yīng)用于臨床MRI成像；貴金屬、同位素合成的納米探針在分子影像學(xué)中的應(yīng)用仍處在基礎(chǔ)性研究階段；光學(xué)、光聲成像技術(shù)為新興生物醫(yī)學(xué)影像發(fā)展提供著必要支持；拉曼、熒光、光聲等納米探針也將隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步朝著靶向、高靈敏、多模、無毒的方向發(fā)展[62]。然而，即便納米探針已經(jīng)在許多動物實(shí)驗中獲得了較為滿意的成果,由實(shí)驗向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化尚需進(jìn)一步探索。

金納米材料依其獨(dú)特的理化性質(zhì)在醫(yī)學(xué)上展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，而針對其生物安全性的研究也應(yīng)引起關(guān)注。

今后穴位敏化的分子影像學(xué)研究將從穴位特性的相關(guān)因素入手，運(yùn)用新興的納米分子影像學(xué)技術(shù)，聚焦穴位敏化現(xiàn)象，捕捉敏化過程的動態(tài)變化，對敏化現(xiàn)象進(jìn)行直觀量化，探尋規(guī)律，有助于充穴的科學(xué)內(nèi)涵，為進(jìn)一步探討穴位敏化的物質(zhì)基礎(chǔ)提供客觀的影像學(xué)依據(jù)，豐富并完善中醫(yī)針灸理論，推動針灸學(xué)的傳承與發(fā)展。

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A Progress of Nanomolecular Imaging Methods in the Acupoint Sensitization Research

Cao Jin, Li Yujie, Wang Xin, Lu Menghan, Yang Lijuan, Mou Qiujie, Liu Juntong, Zhao Jianghao, Jiang Jing, Li Zhigang
(School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Acupoint sensitization is a dynamic process of receiving stimuli and regulating functional activities of the body. Though some desirable results were achieved by applying molecular imaging methods to acupoint sensitization research, there were still some neglected limitations, such as spatiotemporal dynamics, dynamics of some characteristic compound and specific molecular probes. In the surge of the development of molecular imaging techniques, not only biophysical mordifications, but cellular and molecular alterations can be profoundly explored. Frontiers of nanotechnology is used widely in the field of biomedical science. Based on their vantages, nano-bio-imaging technology is the fusion of biological imaging technology and nanobiotechnology. At the cutting edge, the technology provides a foundation for understanding the process of acupoint sensitization in the sight of intracellular structure, outlining the scientific evidence behind the material basis of acupoint sensitization.

Acupoint, sensitization, molecular imaging, nanoparticle probe

10.11842/wst.2016.08.012

R285.5

A

（責(zé)任編輯：董曉娜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-08-24

修回日期：2016-08-30

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項目（81473774）：基于“通督啟神”法探討不同電針對AD模型小鼠不同腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化通路的影響，負(fù)責(zé)人：李志剛；國家自然科學(xué)基金委重大項目（81590952）：穴位敏化的客觀顯像研究，負(fù)責(zé)人：李志剛。

＊＊ 通訊作者：李志剛，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：針刺手法及針刺干預(yù)中樞神經(jīng)損傷的機(jī)理研究。