HPLC法測定豬膽粉中的牛磺豬去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸

譚春梅， 陸靜嫻， 王征南

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310004）

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HPLC法測定豬膽粉中的?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸

譚春梅， 陸靜嫻， 王征南

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310004）

摘要：目的 建立HPLC-UV法同時測定豬膽粉中?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸的含有量。方法 豬膽粉甲醇提取液采用Kromasi1C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析；流動相乙腈-0.03 mo1/L磷酸二氫鈉，梯度洗脫；體積流量1.0 m L/min；柱溫25℃；檢測波長200 nm。結(jié)果 ?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸分別在0.087 7～4.384 9 μg（r=1.000 0）、0.257 8～8.594 6 μg（r=1.000 0）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率在95.0％～105.0％之間，RSD均小于3.0％。結(jié)論 該方法簡單、可靠，適用于豬膽粉的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：豬膽粉；?；秦i去氧膽酸；甘氨豬去氧膽酸；HPLC

豬膽粉為豬科動物豬Susscrofa domestica Brisson膽汁的干燥品，具有清熱潤燥、止咳平喘、解毒的作用，用于頓咳、哮喘、熱病燥渴、目赤、喉痹、黃疸、泄瀉、痢疾、便秘、癰瘡腫毒［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，豬膽粉具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤作用［2-3］，其主要成分為膽汁酸，包括結(jié)合型和游離型膽酸，以前者為主。目前，相關(guān)研究基本集中在后者［4-8］，而且在測定其含有量時基本采用水解后測定或柱前衍生化法，專屬性不強，但對占比較高、活性較強的結(jié)合型膽酸的研究較少［9-10］。因此，本實驗采用HPLC-UV法測定豬膽粉中含有量較高的結(jié)合型膽酸?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸，用以更好的控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ag1ient 1200高效液相色譜儀（美國Agi1ent公司）；賽多利斯CP225D電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥 ?；秦i去氧膽酸（111943-201301）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；甘氨豬去氧膽酸對照品（G641390）（加拿大多倫多研究化學(xué)品公司，純度98％）。乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸水。豬膽粉10批，批號分別為120401、120502、120603、120906、121002、121004、121005、121105、121205、130105（福建省仙游縣南豐生化有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasi1-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5.0 μm）；流動相乙腈（A）-0.03 mo1/L磷酸二氫鈉（B，磷酸調(diào)pH=4.4），梯度洗脫（0～40 min，28％→36％ A，72％→64％ B）；檢測波長200 nm；體積流量1.0 mL/min；檢測波長200 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。對照品及供試品色譜圖見圖1。

1.?；秦i去氧膽酸 2.甘氨豬去氧膽酸1.taurohyodeoxycho1ic acid 2.g1ycy1hyodeoxycho1ic acid圖1　混合對照品和樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms ofm ixed reference substances and sam ples

2.2 混合對照品溶液的配制 精密稱取牛磺豬去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.1和0.3 mg相應(yīng)成分的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品（批號120502）粉末約0.1 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲（500 W、40 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 μL進樣分析，即得。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系 分別配制系列濃度?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸的對照品溶液（n =6），在“2.1”項色譜條件下進樣分析。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到兩者的回歸方程分別為y=458.95x+ 5.235（r=1.000 0）、y=568.84x+1.390 4（r= 1.000 0）。結(jié)果表明，?；秦i去氧膽酸在0.087 7～4.384 9 μg，甘氨豬去氧膽酸在0.257 8～8.594 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

3.2 精密度試驗 取一定濃度的混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸峰面積。結(jié)果，兩者的峰面積RSD分別為0.8％和1.0％，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗 取豬膽粉供試品（批號120502）適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、17、25 h進樣測定峰面積。結(jié)果，?；秦i去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸的峰面積RSD分別為1.7％和0.8％，表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗 取豬膽粉供試品（批號120502）適量，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液進行測定。結(jié)果，牛磺豬去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸的峰面積RSD分別為2.3％和1.1％，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率 稱取含有量已知的供試品（批號120502）約20 mg，共6份，置于25 mL量瓶中，分別加入0.069 06 mg/mL?；秦i去氧膽酸10.0 mL和0.923 9 mg/mL甘氨豬去氧膽酸4.0 mL，適量甲醇溶解，超聲（500 W、40 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

3.6 樣品測定 取10批供試品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并測定?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸的含有量，結(jié)果見表2。

表2　?；秦i去氧膽酸和甘氨豬去氧膽酸含有量Tab.2 Contents of taurohyodeoxycholic acid and glycohyodeoxycholic acid

4 討論

結(jié)合型膽酸屬于末端吸收，本實驗采用二極管陣列檢測器，記錄200～400 nm范圍內(nèi)的光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200 nm波長處色譜峰響應(yīng)均較大，基線噪音較小，因此選擇200 nm作為檢測波長。另外，甲醇在205 nm處有末端吸收，故采用乙腈-磷酸鹽流動相進行梯度洗脫，能獲得較好的分離效果，而且噪音波動較小。

選擇色譜柱時，考察了Kromasi1-C18、Shimaduzu-C18、Diamonsi1-C18（4.6 mm×25 mm，5 μm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)除色譜峰保留時間略有變化外，對色譜峰的分離度及峰形均無明顯影響。

選擇柱溫時，考察同一根C18色譜柱對同一份供試品溶液（批號120502）分別在柱溫20、25、30℃進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫對樣品分離度無明顯的區(qū)別，但在25℃下分離最為理想，故規(guī)定柱溫為25℃。

很多文獻以測定豬膽粉中水解產(chǎn)物為主，但水解后成分不專屬，本實驗采用HPLC-UV法測定豬膽粉中結(jié)合型膽酸類成分甘氨豬去氧膽酸和牛磺豬去氧膽酸，具有較高的專屬性，而且方法較簡便，能夠快速的測定豬膽粉中該兩類成分的含有量。

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［飲片炮制］

Determ ination of taurohyodeoxycholic acid and glycohyodeoxycholic acid in Pulvis Fellis Suis by HPLC

TAN Chun-mei， LU Jing-xian， WANG Zheng-nan
（Zhejiang Provincial Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 31OOO4，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining taurohyodeoxycho1ic acid and g1ycohyodeoxycho1ic acid in Pulvis Fellis Suis.METHODS The ana1ysis of Pulvis Fellis Suismethano1ic extractwas performed on Kromasi1C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm），mobi1e phase was acetonitri1e-0.03 mo1/L sodium dihydrogen phosphate with gradiente1ution，f1ow ratewas1.0 mL/min，co1umn temperaturewasmaintained at25℃，and detection wave1ength was set at200 nm.RESULTS Taurohyodeoxycho1ic acid and g1ycohyodeoxycho1ic acid hadbook=123,ebook=129good 1inear re1ationships in the ranges of 0.087 7 -4.384 9 μg（r=1.000 0）and 0.257 8 -8.594 6 μg（r= 1.000 0），respective1y.The average recoverieswere 95.0％ -105.0％.The RSDswere 1ess than 3.0％.CONCLUSION Thismethod is simp1e and re1iab1e，which is suitab1e for the qua1ity contro1of Pulvis Fellis Suis.

KEY WORDS：Pulvis Fellis Suis；taurohyodeoxycho1ic acid；g1ycohyodeoxycho1ic acid；HPLC

作者簡介：譚春梅（1983—），女，碩士，主管中藥師，從事藥品標準制定和質(zhì)量檢驗工作。Te1：（0571）86459425，E-mai1：tanchunmei83@163.com

收稿日期：2015-03-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.027

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0122-04