基于色譜-光譜儀聯(lián)用和子空間夾角法分析丹皮酚含量

閆一夫， 姚志湘*， 劉 柳， 粟 暉， 李張升， 呂金星

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006）

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基于色譜-光譜儀聯(lián)用和子空間夾角法分析丹皮酚含量

閆一夫1，2， 姚志湘1，2*， 劉 柳1，2， 粟 暉1，2， 李張升1，2， 呂金星1，2

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006）

摘要：目的 將色譜-光譜儀（HPLC-UV）聯(lián)用法與空間夾角判據(jù)結(jié)合，用于快速分析丹皮酚含有量。方法 通過色譜-光譜聯(lián)用采集丹皮酚的紫外多波長光譜三維數(shù)據(jù)，構(gòu)建不含被測組分的本底數(shù)據(jù)庫，然后基于向量-空間夾角法步驟測定了丹皮酚的含有量。結(jié)果 分析結(jié)果和高效液相色譜法所得結(jié)果接近，相對誤差小于5.00％，回收率為97.3％～102.5％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.5％。結(jié)論 該方法快速、準(zhǔn)確，可為丹皮酚質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：丹皮酚；子空間夾角；HPLC-UV

1 前言

丹皮酚藥理應(yīng)用價值廣泛，除用于醫(yī)療制劑原料外，還用于牙膏、護(hù)膚、美容等日化品中，其含有量測定是各種制劑和產(chǎn)品質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一?！吨袊幍洹?005年版規(guī)定，以丹皮酚含有量為檢查牡丹皮、徐長卿及六味地黃丸質(zhì)量的定量指標(biāo)［1］；《中國藥典》2010年版收載了牡丹皮中丹皮酚的高效液相色譜（HPLC）含有量測定方法［2］，另外還有文獻(xiàn)報(bào)道了同時測定牡丹皮中丹皮酚和芍藥苷含有量的HPLC法［3］和近紅外光譜分析法［4-5］，雖然兩者靈敏度好，但分析成本高，操作強(qiáng)度大，大批量樣本的分析效率低，故需要建立一種丹皮酚含有量的快速分析新方法。

姚志湘等［6-7］提出采用“向量-子空間夾角”作為判據(jù)，用于判斷組分在體系中是否存在，并采用與滴定操作類似的逐步扣減，判斷出組分恰好消失的“等當(dāng)點(diǎn)”，實(shí)現(xiàn)“數(shù)學(xué)滴定”。該方法已經(jīng)運(yùn)用于化妝品中對羥基苯甲酸酯的測定［8］、醬油中苯甲酸鈉和山梨酸鉀的測定［9］、維生素E油酸酯，維生素E與油酸的同時測定［10］，分析速度快，測定效果理想。

本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，然后對不同批次丹皮酚結(jié)晶母液樣品進(jìn)行高效液相色譜-光譜儀（HPLC-UV）聯(lián)用，采集各樣品經(jīng)色譜分離后的紫外光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，獲得不含被測組分丹皮酚的本底數(shù)據(jù)。根據(jù)本底數(shù)據(jù)與待測樣本的紫外光譜，再采用空間夾角判據(jù)算法直接分析待測樣本中丹皮酚含量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；Maya2000紫外-可見光纖光譜儀（海洋光學(xué)亞洲公司）；AL104電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超聲波清洗機(jī)（上海之信儀器有限公司）。

無水乙醇為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純。丹皮酚對照品（純度99.9％）。丹皮酚結(jié)晶母液（廣西億康制藥業(yè)有限公司）。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)光譜庫建立 精密稱取丹皮酚對照品0.101 0 g，75％乙醇定容至100 mL，依次配制質(zhì)量濃度為2、4、8、12、16、20 mg/L的丹皮酚-75％乙醇溶液B1～B6。然后，采集各溶液200～400 nm下紫外光譜，經(jīng)最小二乘回歸得到標(biāo)準(zhǔn)光譜庫V。

2.1.2 待測樣本的制備及紫外光譜采集 室溫下，分別取丹皮酚結(jié)晶母液上層溶液約0.15 g和下層晶體，75％乙醇稀釋到一定濃度，得到樣本S1和S2。取不同生產(chǎn)批次的丹皮酚結(jié)晶母液兩份，加熱至50℃成熔融狀態(tài)，分別稱取1.2和0.9 g，75％乙醇稀釋到一定濃度，得到樣本S3和S4。稱取丹皮酚結(jié)晶產(chǎn)品0.1 g，75％乙醇稀釋到一定濃度，得到樣本S5。取S1～S4等體積混合，得到樣本S6。

采集S1～S6的紫外光譜數(shù)據(jù)，得到待測樣本數(shù)據(jù)庫，記為D。積分時間15微秒；積分次數(shù)20次；波長200～400 nm。

2.1.3 建模本底數(shù)據(jù)庫的建立 取待測樣品S1～S6和丹皮酚對照品樣本B3，通過液相色譜與光譜儀聯(lián)用，采集各樣本經(jīng)過色譜柱完全分離后的多波長光譜數(shù)據(jù)。再從待測樣品光譜數(shù)據(jù)中扣除待測組分丹皮酚的光譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)數(shù)據(jù)降維［11］，得到本底光譜數(shù)據(jù)庫N。

液相色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm），梯度洗脫（0～30 min，乙腈∶水= 40∶60；30～55 min，乙腈∶水=5∶95；55～80 min，乙腈∶水=95∶5）；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫20℃；檢測波長270 nm。

光譜條件：流動比色皿（1 cm）；積分時間15微秒；積分次數(shù)20次；紫外檢測波長200～400 nm。

2.1.4 待測樣本中丹皮酚含有量測定 將數(shù)據(jù)庫V、N以及D導(dǎo)入MATLAB［12-13］，選取200～400 nm波長段，應(yīng)用向量-子空間夾角判據(jù)算法［14］（簡稱VS法）分別計(jì)算各待測樣本中丹皮酚的含有量。

2.2 回收率試驗(yàn) 分別取S2、S4和S5各3份，每份10 mL，分別加入8、12、16 mg/L 3個質(zhì)量濃度的丹皮酚對照品溶液10 mL，混合均勻后采集其多波長紫外光譜，采用空間夾角判據(jù)計(jì)算含有量值和該方法的回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)光譜庫的建立 配制2～20 mg/L系列質(zhì)量濃度的丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，以75％乙醇為空白，采集系列溶液的190～1 100 nm波長范圍光譜。再選擇200～400 nm波長范圍光譜，經(jīng)多變量最小二乘回歸后得到丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)光譜yi=aix+bi，記為V。其中，在270 nm處的線性方程為y= 0.079 2x-0.063 6，r=0.999 2。

3.2 本底數(shù)據(jù)庫的建立 將丹皮酚對照品溶液B3和混合樣本S6的液相色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。其中，A為丹皮酚的出峰時間，對應(yīng)16.3～17.5 min，從S6的光譜數(shù)據(jù)中扣除與丹皮酚具有相同保留時間的光譜數(shù)據(jù)（如圖1中A峰數(shù)據(jù)），其余數(shù)據(jù)（B峰數(shù)據(jù)）則作為測定丹皮酚含有量的本底數(shù)據(jù)。再依次從樣品S1～S5的光譜數(shù)據(jù)中分別扣除16.3～17.5 min時間段的光譜數(shù)據(jù)所對應(yīng)的列，存入本底數(shù)據(jù)庫中，記為M1～M5。合并M1～M6數(shù)據(jù)，構(gòu)成數(shù)據(jù)庫M。

圖1　丹皮酚母液和對照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of paeonolmother liquor and reference substance

液相-光譜聯(lián)用獲取的初始本底光譜數(shù)據(jù)M數(shù)據(jù)量大，若直接采用，運(yùn)算時間長，影響了方法的時效性，因此需要對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，以去除數(shù)據(jù)中的噪聲和冗余的維數(shù)，保留效性數(shù)據(jù)、并能夠提高算法的處理速度。本實(shí)驗(yàn)選用主成分分析的方法判斷體系主成分為8，將M經(jīng)奇異值分解［11］，取降解后U矩陣的前8列，即為降維后的本底數(shù)據(jù)庫N。

3.3 樣品中丹皮酚的測定 根據(jù)待測樣品樣本S1～S5的紫外光譜數(shù)據(jù)與本底數(shù)據(jù)庫N，按空間夾角判據(jù)的算法步驟計(jì)算丹皮酚的含有量。同時，和高效液相色譜計(jì)算出的丹皮酚含有量值進(jìn)行比對，結(jié)果見表1。

表1　兩種方法的測定結(jié)果Tab.1 Determ ination results of two methods

由表可以看出，采用空間夾角判據(jù)計(jì)算結(jié)果和高效液相色譜結(jié)果相接近，相對誤差小于1.80％，表明該方法的準(zhǔn)確度較好，而且對于不參與本底數(shù)據(jù)庫建立的樣本同樣具有準(zhǔn)確性。

3.4 方法回收率（表2） 由表可知，樣品回收率范圍在97.3％～102.5％之間，相對誤差小于2.67％，RSD值為1.5％（n =9）。從結(jié)果可以看出，用向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算出來的丹皮酚的含有量與實(shí)際添加量相接近，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

表2　回收率試驗(yàn)Tab.2 Recovery tests

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過液相-紫外可見光譜儀聯(lián)用，結(jié)合子空間-夾角判據(jù)，建立了丹皮酚含有量快速分析方法。對于同類樣品的測定，一旦本底數(shù)據(jù)庫建立好，只需測試待測樣品的UV數(shù)據(jù)，即可實(shí)現(xiàn)待測樣品中物質(zhì)含有量的分析。與高效液相色譜法相比，該方法穩(wěn)定可靠、操作簡便，可以實(shí)現(xiàn)對待測丹皮酚樣品的即時測量，為丹皮酚含有量快速測定提供了一種比較實(shí)用的定量分析技術(shù)，并可推廣應(yīng)用于其它丹皮酚制品檢測領(lǐng)域。

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Determ ination of paeonol based on HPLC-UV and space angle criterion

YAN Yi-fu1，2， YAO Zhi-xiang1，2*， LIU Liu1，2， SU Hui1，2， LIZhang-sheng1，2， LV Jin-xing1，2
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，GuangxiUniversity of Science and Technology，Liuzhou 545OO6，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Liuzhou 545OO6，China）

ABSTRACT：AIM To combine HPLC-UV with space ang1e criterion for rapid1y determining the content of paeono1.METHODS Themu1ti-UV spectrum three-dimensiona1data of paeono1were co11ected by HPLC-UV to estab1ish background spectrum databasewithout detected constituents.Then the contentof paeono1was determined on the basis of space ang1e criterion.RESULTS The ana1ytica1 resu1t obtained by thismethod was simi1ar to that obtained by HPLC.The re1ative errorwas 1ess than 5.00％，whose recoveries ranged from 97.3％ to 102.5％ with the RSD of 1.5％.CONCLUSION Thismethod is rapid and accurate，which can provide a reference for the qua1ity contro1of paeono1.

KEY WORDS：paeono1；space ang1e criterion；HPLC-UV

*通信作者：姚志湘（1968—），男，博士，教授，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程和過程分析技術(shù)。E-mai1：zxyao@gxut.edu.cn

作者簡介：閆一夫（1989—），男（滿族），碩士，研究方向?yàn)檫^程分析技術(shù)。Te1：15156509979，E-mai1：578990746@qq.com

基金項(xiàng)目：廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻1355010-15）；廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFAA118056）

收稿日期：2015-04-17

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.025

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0114-04