天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對RANKL誘導(dǎo)破骨細胞的影響

王 南， 唐 琴， 姬芳玲， 竇 佳， 包永明*

（1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連市藥品檢驗所，遼寧大連116029）

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天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對RANKL誘導(dǎo)破骨細胞的影響

王 南1， 唐 琴1， 姬芳玲1， 竇 佳2*， 包永明1*

（1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連市藥品檢驗所，遼寧大連116029）

摘要：目的 研究天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成以及成熟破骨細胞活性的影響。方法 小鼠巨噬細胞RAW264.7在核因子κB受體活化因子配體（RANKL）誘導(dǎo)下形成破骨細胞，誘導(dǎo)過程中加入天山雪蓮細胞培養(yǎng)物（以天山雪蓮總黃酮計算），通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和Hoechst33342染色觀察破骨細胞形成，以對硝基苯磷酸酯作底物檢測TRAP活性；對誘導(dǎo)形成的破骨細胞進行乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測和Annexin V-PI雙染流式細胞術(shù)進行細胞凋亡檢測，RT-PCR檢測Trap和基質(zhì)金屬蛋白酶（Mmp9）mRNA的表達。結(jié)果 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物能夠顯著抑制破骨細胞的形成以及TRAP酶活；天山雪蓮總黃酮小于125 μg/mL時，對破骨前體細胞RAW264.7無細胞毒性，但會破壞成熟破骨細胞細胞膜，顯著提高胞外LDH酶活性，并誘導(dǎo)破骨細胞凋亡；62.5 μg/mL天山雪蓮總黃酮會顯著下調(diào)破骨細胞的標(biāo)志物Trap和Mmp9 mRNA表達。結(jié)論 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成有抑制作用，并能破壞已形成的破骨細胞，降低骨吸收活性。

關(guān)鍵詞：天山雪蓮；細胞培養(yǎng)物；破骨細胞；抗酒石酸酸性磷酸酶；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；細胞凋亡

包永明（1963—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為蛋白質(zhì)及酶工程、生物催化與轉(zhuǎn)化、藥物化學(xué)及藥理。Te1：（0411）84706344，E-mai1：biosci@d1ut.edu.cn

雪蓮（Saussurea involucrata）已經(jīng)被列為國家二級瀕危植物，是西藏、新疆等高原寒帶地區(qū)常用的民族藥和民間藥。具有活血通經(jīng)、散寒除濕、強筋骨、溫腎助陽、調(diào)節(jié)體液異常等功效。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，提高雪蓮中藥效成分的量，具有周期短、不受季節(jié)和氣候等自然條件限制的優(yōu)點，是解決自然資源不足的理想方法［1］。

破骨細胞（osteoc1asts，OC）是人體生理性骨重建和病理性骨破壞過程中高度特異性的唯一具有骨質(zhì)吸收功能的多核巨細胞，在骨質(zhì)疏松等疾病的研究中起關(guān)鍵作用［2-3］。破骨細胞屬于終末細胞，不能分化傳代，分離純化困難。將破骨細胞前體定向誘導(dǎo)為破骨細胞是目前較理想的獲得破骨細胞的方法。RAW264.7細胞是小鼠源性破骨細胞前體細胞，直接用加RANKL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)RAW264.7細胞，即可形成穩(wěn)定的成熟破骨細胞［4］。

本實驗以RAW264.7細胞為研究對象，探究天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成的影響以及對成熟破骨細胞的作用，為國家新資源食品天山雪蓮細胞培養(yǎng)物抗骨質(zhì)疏松的功效學(xué)研究和功能食品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株 小鼠巨噬細胞RAW264.7，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）（美國Gibco-BRL生命技術(shù)有限公司）；噻唑藍（MTT）（美國Invitrogen有限公司）；核因子κB受體活化因子（RANKL）（美國Sigma公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶染液試劑盒（TRAP）（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、細胞凋亡試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司）；對硝基苯基磷酸酯（百靈威）；Trizo1試劑、瓊脂糖（美國Invitrogen有限公司）；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H Free）（2641Q，大連寶生物工程有限公司）；各種引物合成、RT-PCR中使用的酶（華大基因）。

1.3 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物 樣品由大連普瑞康生物技術(shù)有限公司提供。雪蓮細胞培養(yǎng)物的加工工藝：選取雪蓮離體組織，經(jīng)脫分化形成的愈傷組織作為繼代種子，給予一定條件進行繼代培養(yǎng)而獲得的團塊狀顆粒，或該顆粒經(jīng)干燥粉碎得到的粉末。雪蓮細胞培養(yǎng)物的提取工藝：在雪蓮培養(yǎng)物中加入30％乙醇溶液，雪蓮培養(yǎng)物與乙醇的體積比為1∶15，超聲提取，溫度為85℃，每次提取60 min，連續(xù)提取2次，兩次所得液體采用60℃減壓濃縮獲得實驗樣品。以蘆丁作為對照品，分光光度計法檢測500 nm光密度（D）值，計算總黃酮的量，以總黃酮的量作為天山雪蓮細胞培養(yǎng)物的質(zhì)量指標(biāo)。

1.4 實驗儀器 垂直層流潔凈工作臺（上海凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Hera ce11150，美國Thermo公司）；熒光顯微鏡（IX71，日本O1ympus公司）；冷凍離心機（Biofuge Stratos，美國Thermo公司）；全波長掃描熒光酶標(biāo)儀（Varioskan F1ash，美國Thermo公司）；PCR儀（Takara TP-600，日本Takara公司）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)和破骨細胞誘導(dǎo) 小鼠巨噬細胞RAW264.7，利用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，在5％ CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。傳代1～2次后待細胞再次完全融合，胰蛋白酶消化后培養(yǎng)，以2×104/孔接種于24孔板，培養(yǎng)12 h貼壁后加入50 ng/mL RANKL誘導(dǎo)破骨細胞生成。誘導(dǎo)6 d后在倒置顯微鏡下觀察，有多核細胞形成［5-6］，進行TRAP染色和Hoechst33342熒光染料染色。

2.2 MTT法測定細胞增殖 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，以1 000個/孔細胞接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入黃酮質(zhì)量濃度為15.625～500 μg/mL的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物。藥物作用6 d后去除培養(yǎng)基，加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL）37℃孵育4 h。小心吸取上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解紫色結(jié)晶甲瓚，混勻。使用酶標(biāo)儀檢測其在570 nm波長下的吸光度值，以630 nm波長下吸光度值為參照。

2.3 乳酸脫氫酶活性測定 乳酸脫氫酶（1actate dehydrogenase，LDH）是機體能量代謝的一種重要酶，檢測胞內(nèi)和胞外LDH的量，是評價細胞膜完整性的一個重要指標(biāo)。RAW264.7細胞以1 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后加入RANKL（50 ng/mL）誘導(dǎo)6 d生成破骨細胞。然后加入不同黃酮質(zhì)量濃度的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物（31.25、62.5、125 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書進行LDH活性測定。

2.4 破骨細胞TRAP活性測定 以1×104個/mL RAW264.7種于6 cm細胞培養(yǎng)板中，每板4 mL。培養(yǎng)12 h后加入RANKL誘導(dǎo)劑（50 ng/mL）和不同黃酮質(zhì)量濃度的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物（31.25、62.5、125 μg/mL）共培養(yǎng)6 d，對照組和誘導(dǎo)組分別加入等體積的DMEM培養(yǎng)基和RANKL誘導(dǎo)劑（50 ng/mL）。處理結(jié)束后，收集細胞，用PBS清洗1～2遍后加入細胞裂解液提取細胞內(nèi)總蛋白。加入100 μL檸檬酸鹽緩沖液（50 mmo1/L，pH 4.6，含10 mmo1/L酒石酸鈉和5 mmo1/L對硝基苯基磷酸酯），孵育1 h。反應(yīng)混合液中加入100 μL 0.1 mmo1/L的NaOH終止反應(yīng)。取200 μL反應(yīng)液加入到96孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測其在410 nm下吸光度值，TRAP活性以相對對照組百分比表示［7］。

2.5 RNA提取及RT-PCR 參照“2.4”項下方法處理細胞，采用Trizo1法提取總RNA，Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）進行RNA反轉(zhuǎn)錄。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Gapdh）基因表達作為參照，PCR擴增序列為：

①Mouse Trap正向引物為5'-TGACAAGAGGTTCCAGGA-3'，反向引物為5'-AGCCAGGACAGCTGAGTG-3'；

②Mouse Mmp9正向引物為5'-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3'，反向引物為5 '-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3'；

③Mouse Gapdh正向引物為5'-AAGCCCATCACCATCTTCCAG-3'，反向引物為5'-AGGGGCCATCCA CAGTCTTCT-3'。

PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5 min后進入循環(huán)；94°C變性30 s，55°C復(fù)性30 s，68°C延伸1 min，循環(huán)33次；最后72°C延伸7 min。

2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，用含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×104/孔于6孔板中，在37℃培養(yǎng)24 h，加入RANKL誘導(dǎo)劑（50 ng/mL）和不同黃酮質(zhì)量濃度的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物（31.25、62.5、125 μg/mL）共培養(yǎng)6 d，對照組和誘導(dǎo)組分別加入等體積的DMEM培養(yǎng)基和RANKL誘導(dǎo)劑（50 ng/mL）。收集細胞并用PBS液清洗2次。加入磷脂結(jié)合蛋白-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）混勻后，室溫避光反應(yīng)10 min，加入碘化丙啶（PI）繼續(xù)反應(yīng)3～4 min，上流式細胞儀進行檢測。

3 結(jié)果

3.1 RAW264.7細胞誘導(dǎo)成為破骨細胞 50 ng/mL RANKL誘導(dǎo)6 d后，RAW264.7被誘導(dǎo)成為圓形、橢圓形或不規(guī)則形的多核細胞，該細胞可被TRAP染色，細胞周圍可見凸起的偽足，如圖1所示。

圖1　抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察破骨細胞形態(tài)Fig.1 Observation of osteoclastmorphology by TRAP staining

3.2 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成的影響

3.2.1 RAW264.7細胞增殖（MTT）檢測 MTT法檢測不同質(zhì)量濃度天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對RAW264.7活力影響，如圖2所示，當(dāng)培養(yǎng)物中黃酮質(zhì)量濃度為15.625～125 μg/mL對RAW264.7細胞沒有毒性，并且31.25、62.5和125 μg/mL質(zhì)量濃度的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對RAW264.7細胞具有明顯地促進增殖的作用（P＜0.01）。于是選取天山雪蓮細胞培養(yǎng)物31.25、62.5和125 μg/mL用于后續(xù)實驗。

圖2　天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對RAW 264.7細胞增殖的影響Fig.2 Effect of S.involucrata cell culture on the proliferation of RAW 264.7 cells

3.2.2 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成和TRAP酶活影響 如圖3A所示，誘導(dǎo)組加入50 ng RANKL誘導(dǎo)6 d后形成較多的破骨細胞，且形成的胞體較大。加入天山雪蓮細胞培養(yǎng)物后破骨細胞形成數(shù)少于誘導(dǎo)組。

天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞TRAP酶活的影響如圖3B，相對于誘導(dǎo)組，加入黃酮質(zhì)量濃度為31.25、62.5、125 μg/mL的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物均顯著降低了TRAP酶活（P＜0.05或P＜0.01），分別為誘導(dǎo)組的（93.36±3.99）％、（71.09±4.73）％、（54.28±2.07）％。

圖3　天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成和抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影響Fig.3 Effects of S.involucrata cell culture on the form ation and TRAP activity of osteoclasts

3.3 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞的影響

3.3.1 乳酸脫氫酶活性檢測 如圖4所示，與誘導(dǎo)組相比，加入天山雪蓮細胞培養(yǎng)物（31.25、62.5、125 μg/mL）處理破骨細胞48 h后，其釋放到細胞外的LDH酶活分別為（112.10±2.21）％、（115.06±1.57）％和（116.73±0.33）％（P＜0.01），表明天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞細胞膜有極顯著的破壞作用。

圖4　天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞乳酸脫氫酶活性的影響Fig.4 Effect of S.involucrata cell culture on LDH activity of osteoclasts

3.3.2 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞凋亡的影響 如圖5所示，誘導(dǎo)組破骨細胞凋亡率為19.6％，而加入黃酮質(zhì)量濃度為31.25、62.5、125 μg/mL的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物后，凋亡率分別提高到了26.2％、44.3％和67.9％。

3.3.3 天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對Trap和Mmp9表達的影響 如圖6所示，RANKL誘導(dǎo)形成的破骨細胞可以表達成熟破骨細胞表型標(biāo)志基因Trap和Mmp9。而在加入天山雪蓮細胞培養(yǎng)物后，Trap和Mmp9基因的表達均有下調(diào)的趨勢。62.5、125 μg/mL的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物能夠顯著下調(diào)Trap和Mmp9基因表達。

圖5　天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞凋亡率的影響Fig.5 Effect of S.involucrata cell culture on the apoptosis rate of osteoclasts

圖6　天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 m RNA表達的影響Fig.6 Effects of S.involucrata cell culture on the expressions of Trap and Mmp9 m RNA in osteoclasts

4 討論

天山雪蓮細胞培養(yǎng)物中主要是黃酮、生物堿和多糖等活性化合物，具有多種藥理活性，如緩解疲勞、抗炎鎮(zhèn)痛、降低血脂、抗氧化、增強免疫力、抗輻射、增加骨密度等。然而關(guān)于天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞形成的影響還有待研究，本實驗初步發(fā)現(xiàn)，天山雪蓮細胞培養(yǎng)物能夠抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細胞的形成，并對破骨細胞有破壞作用。

健康的骨骼通過持續(xù)的骨重塑來維持，破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收及成骨細胞（osteob1asts，OB）介導(dǎo)的骨形成貫穿著人體整個生命周期，而破骨細胞功能的失調(diào)會導(dǎo)致各種代謝性骨病。破骨細胞是一類高度分化的多核巨細胞，不能傳代，且生命周期短暫［8］，可由骨髓、脾及外周血內(nèi)的造血干細胞或骨髓遠祖細胞經(jīng)分化、融合而成。破骨細胞的分化主要受骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞所分泌的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子-κB活化因子受體配體（RANKL）及骨保護素（OPG）等因子的調(diào)控。RANKL是促進破骨細胞成熟的必要因素，在RANKL誘導(dǎo)下，RAW264.7細胞能夠分化成破骨細胞，并高表達破骨細胞相關(guān)基因Trap［9］。TRAP被認(rèn)為是破骨細胞所特有的功能性標(biāo)記酶，參與骨基質(zhì)中鈣磷礦化底物的降解，其水平可反映破骨細胞的活性和骨吸收的狀態(tài)［10］。在RANKL細胞誘導(dǎo)過程中加入天山雪蓮細胞培養(yǎng)物可顯著抑制多核破骨細胞形成，TRAP活性也可降至誘導(dǎo)組的50％～90％。黃酮質(zhì)量濃度為62.5和125 μg/mL的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物作用于成熟的破骨細胞，Trap基因的表達也有顯著下調(diào)趨勢。除此之外，MMP9的量也是破骨細胞溶骨活性的標(biāo)志，MMP9通過促進破骨細胞移動到骨吸收表面來參與骨吸收過程［11］。黃酮質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL的天山雪蓮細胞培養(yǎng)物能夠顯著降低破骨細胞中Mmp9基因的表達。

LDH是一種胞內(nèi)酶，天山雪蓮細胞培養(yǎng)物處理破骨細胞48 h后，細胞膜損傷，使胞外LDH活性顯著增強，呈劑量依賴性。采用Annexin V-PI雙染流式細胞術(shù)進行細胞凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)天山雪蓮細胞培養(yǎng)物能夠誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，且凋亡率變化呈劑量依賴性；這一結(jié)果與LDH活性結(jié)果一致。而MTT結(jié)果表明，天山雪蓮細胞培養(yǎng)物黃酮質(zhì)量濃度在≤125 μg/mL時對RAW264.7細胞無毒，說明胞外LDH活性的增強和凋亡率的提高是由于天山雪蓮細胞培養(yǎng)物對破骨細胞的毒性作用。

綜上所述，天山雪蓮細胞培養(yǎng)物能夠抑制RANKL誘導(dǎo)RAW264.7破骨細胞的形成；并能誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，從而降低破骨細胞的骨吸收活性。

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Effects of Saussurea involucrata cell cultures on RANKL-induced osteoclastogenesis

WANG Nan1， TANG Qin1， JIFang-1ing1， DOU Jia2*， BAO Yong-ming1*
（1.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116O24，China；2.Dalian Institute for Drug Control，Dalian 116O29，China）

ABSTRACT：AIM To investigate the effects of Saussurea involucrata ce11cu1tures on the formation of osteoc1ast as we11 as the activity of mature osteoporosis.METHODS Except in the contro1 group，murine macrophage RAW264.7 ce11s were given the inducingmedium receptor activator of NF-κB 1igand（RANKL）.The effect of S. involucrata ce11 cu1tures（tota1 f1ovenoids from S.involucrata as ca1cu1ated）on osteoc1astogenesiswas observed by tartrate-resistant acid phosphatase（TRAP）and Hoechst 33342 staining and measured by TRAP activity.The viabi1ity of osteoc1astwas detected by LDH assay and f1ow cytometry assay.RT-PCR was emp1oyed to determine the expression 1eve1s of Trap and matrixmeta11oproteinase-9（Mmp9）mRNA in osteoc1ast.RESULTS S.involucrata ce11cu1tures significant1y inhibited RANKL-induced formation ofmu1tinuc1eated osteoc1astand TRAP activity in a dose-dependentmanner.MTT activity assay showed that S.involucrata ce11 cu1tures（≤125 μg/mL）were nontoxic to RAW264.7 ce11s.But it cou1d destroy the ce11 membrane of osteoc1ast，significant1y improving the extrace11u1ar LDH activity and induced apoptosis.S.involucrata ce11 cu1ture marked1y down-regu1ated Trap and Mmp9 mRNA expression at the concentration of62.5 μg/mL.CONCLUSION S.involucrata ce11cu1tures have the potentia1 to inhibit the osteoc1ast differentiation，inducemature osteoc1ast apoptosis and decrease the activity of bone resorption.

KEY WORDS：Saussurea involucrata；ce11 cu1tures；osteoc1ast；TRAP；MMP9；apoptosis

*通信作者：竇 佳（1982—），女，工程師，研究方向為藥品分析與檢驗。Te1：（0411）84255019，E-mai1：djvictory@163.com

作者簡介：王 南（1989—），女，碩士，研究方向為藥物化學(xué)與藥理學(xué)。Te1：18941411788，E-mai1：d1utwangnan@hotmai1.com

收稿日期：2015-03-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.001

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0001-06