家蠶傳染性軟化病病毒熒光定量PCR檢測技術(shù)及浙江省流行病學(xué)調(diào)查

董 強 魯興萌 吳 姍

(1浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058; 2浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江杭州 310016)

家蠶傳染性軟化病病毒熒光定量PCR檢測技術(shù)及浙江省流行病學(xué)調(diào)查

董 強1魯興萌1吳 姍2

(1浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058;2浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江杭州 310016)

熒光定量PCR檢測技術(shù)可實現(xiàn)對病原微生物的早期或快速檢測，根據(jù)家蠶傳染性軟化病病毒(BmIFV)的RNA序列，設(shè)計了具有物種特異性的引物和探針，建立了熒光PCR檢測BmIFV的方法。將設(shè)計的引物和探針同時對BmIFV、家蠶微孢子蟲(Nb)、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)、家蠶濃核病病毒(BmDNV)和桑葉進行特異性驗證，結(jié)果顯示只有BmIFV得到陽性結(jié)果。該方法對含BmIFV目標片段質(zhì)粒的檢測靈敏度達10－3ng/μL，對目標病毒的檢測靈敏度為3.4 ng/μL。同時，對浙江省嘉興市秀洲區(qū)、湖州市南潯區(qū)、嘉興市桐鄉(xiāng)市、嘉興市海寧市、杭州市淳安縣5個蠶區(qū)家蠶感染BmIFV情況進行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示這5個蠶區(qū)BmIFV感染率約為3.6%，為浙江省家蠶傳染性軟化病防治提供參考。

家蠶;家蠶傳染性軟化病病毒;熒光定量PCR;引物和探針;流行病學(xué)

家蠶傳染性軟化病(Bombyx mori infectious flacherie)是由家蠶傳染性軟化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus，BmIFV)引起的一種傳染性蠶病，病蠶一般表現(xiàn)為空頭、體縮和遲眠等外部病癥。該病是蠶業(yè)生產(chǎn)上一種主要的病毒病，在印度主產(chǎn)區(qū)卡納塔克邦(Karnataka)，約有47.9%的養(yǎng)蠶損失是由該病引起的［1］;在日本，病毒性軟化病亦被認為是日本養(yǎng)蠶生產(chǎn)中造成損失的一個主要因素［2］。1926年，法國學(xué)者PAILLOT最早提出家蠶的軟化病由病毒所引起，鏈球菌屬(Streptococcus)和桿菌屬(Bacillus)細菌只是二次侵染菌［3］。1960年，日本學(xué)者山崎壽等從大量發(fā)生軟化病的長野縣農(nóng)家收集病蠶，并通過添食試驗認為該病是由病毒引起的病毒性軟化?。?］。以后AIZAWA等［5］從蠶體對該病毒進行了分離純化并作了超微形態(tài)的觀察。進一步研究證明BmIFV屬細小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，為線性單鏈RNA病毒［2，6］，是造成家蠶發(fā)生病毒性軟化病的病原體。

顯微鏡已被廣泛用于家蠶病原微生物的檢測，但由于BmIFV是非包涵體病毒，在普通光學(xué)顯微鏡下無法看到病毒粒子，而且BmIFV對家蠶所引起的病癥與家蠶濃核病病毒(Bombyx mori densonucleosis virus，BmDNV)及細菌引起的病癥相似［7－8］，因此用肉眼和普通光學(xué)顯微鏡無法對其確診。應(yīng)用血清學(xué)鑒別法鑒別家蠶傳染性軟化病雖具有特異性強、靈敏度高的特點，但也存在比較高的交叉反應(yīng)與非特異性反應(yīng)［9－10］。

本研究建立了1種熒光PCR對BmIFV的檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度進行了驗證。并應(yīng)用該方法對浙江省的嘉興市秀洲區(qū)、湖州市南潯區(qū)、嘉興市桐鄉(xiāng)市、嘉興市海寧市、杭州市淳安縣等5個蠶區(qū)生產(chǎn)上家蠶傳染性軟化病的感染現(xiàn)狀進行了抽查。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 引物和探針設(shè)計 基于BmIFV的RNA序列(GenBank序列號:HM245295.1，HM569717.1，EU868609.1，EF422866.1，AB000906.1)，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用 PRIMER EXPRESS軟件設(shè)計了BmIFV的“印度株”、“日本株”和“浙江株”3個株系的通用引物和探針1組(表1)。

表1 檢測家蠶傳染性軟化病病毒(BmIFV)的引物和探針

1.1.2 試驗樣本 (1)供試病原體。BmIFV、家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis，Nb)、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)、BmDNV均為純化的病原體，由浙江大學(xué)蠶蜂研究所保存和提供。(2)流行性病學(xué)調(diào)查樣品。2015年5月至10月分別從浙江省嘉興市秀洲區(qū)、湖州市南潯區(qū)、嘉興市桐鄉(xiāng)市、嘉興市海寧市、杭州市淳安縣等蠶區(qū)采集到發(fā)育相對較慢的3齡蠶樣60個、5齡蠶樣96個及蠶蛹樣9個。

1.1.3 供試試劑 RNA抽提試劑盒UNIQ－10，為生工生物工程(上海)股份有限公司 (中國)產(chǎn)品。DNase I、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(a First－Strand cDNA Synthesis Kit)、PCR ExBuff、dNTP(2.5 pmol/μL)、MgCl2(25 pmol/μL)、ExTaq(5 U/μL)、Premix Ex Taq、PMD18－T載體，均為寶生物工程(大連)有限公司(中國)產(chǎn)品。DNA抽提試劑盒FF3750，為Promega Corporation(美國)產(chǎn)品。液氮，為杭州今工特種氣體有限公司(中國)產(chǎn)品。

1.1.4 儀器設(shè)備 PTC－200普通PCR儀，MJ Research Inc(美國)產(chǎn)品;PowerPac電泳儀，Bio－Rad Laboratories Inc(美國)產(chǎn)品;Lightcycle 480熒光定量PCR儀，Roche Group(美國)產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 流行性病學(xué)調(diào)查樣品的采集及處理 將

1.1.2 項“(2)流行性病學(xué)調(diào)查樣品”中的每個蠶樣或蛹樣分別取中腸組織和蛹中腸痕跡在液氮中充分研磨，取研磨粉碎后的樣品0.2 g，使用RNA抽提試劑盒UNIQ－10進行RNA抽提，抽提后的RNA用DNase I處理。

1.2.2 BmIFV RNA的提取及BmIFV cDNA合成(1)純BmIFV RNA的提取。取100 μL純BmIFV，使用RNA抽提試劑盒UNIQ－10進行RNA抽提，抽提后得到的RNA用DNase I處理。(2)BmIFV cDNA的合成。取上述純BmIFV抽提得到的RNA 10 μL，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將BmIFV的RNA反轉(zhuǎn)錄成BmIFV cDNA，然后將BmIFV cDNA稀釋5倍后用于Real－Time PCR檢測。

綜上所述，在初中數(shù)學(xué)課堂中要想實現(xiàn)學(xué)生自主探究能力培養(yǎng)這一目的，教師在教學(xué)過程中一定要意識到其重要性，然后在教學(xué)過程中積極為學(xué)生創(chuàng)設(shè)問題情境、展開小組討論、巧設(shè)分層練習(xí)，以此來真正引導(dǎo)學(xué)生參與到探究課程之中，最終也就能夠讓學(xué)生在自主探究與思考中得到更為全面的發(fā)展和進步。

1.2.3 質(zhì)粒的制備 應(yīng)用表 1中的引物，對用BmIFV的RNA合成得到的BmIFV cDNA樣本進行普通PCR擴增，反應(yīng)體系如下:2.5 μL PCR ExBuff，2 μL dNTP(2.5 pmol/μL)，2 μL MgCl2(25.0 pmol/ μL)，0.5 μL正向引物(10.0 pmol/μL)，0.5μL反向引物(10.0 pmol/μL)，0.125 μL ExTaq(5 U/μL)，1 μL BmIFV cDNA，加ddH2O補足至25.0 μL。普通PCR程序如下:94℃，5 min;94℃，30 sec; 60℃，60 sec;72℃，45 sec，40個循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，并割膠回收，將PCR產(chǎn)物純化后，將其克隆至PMD18－T載體上，獲得含有目的DNA片段的質(zhì)粒。

1.2.4 DNA提取 Nb、BmNPV和BmDNV的遺傳物質(zhì)都是DNA，因此對它們分別進行了DNA的提取，程序如下:分別取100 μL的 Nb、BmNPV和BmDNV樣品，使用DNA抽提試劑盒FF3750，按照說明書進行抽提，抽提后得到的 Nb、BmNPV和BmDNV的DNA分別溶解在20 μL ddH2O中。

1.2.5 實時熒光定量PCR擴增檢測 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:10.0 μL Premix Ex Taq，上游引物(10 pmol/μL)0.4 μL，下游引物(10 pmol/μL) 0.4 μL，探針(10 pmol/μL)0.4 μL，1.2.2項“(2) BmIFV cDNA的合成”中稀釋5倍后的BmIFV cDNA液1.0 μL，用ddH2O補足體積至20.0 μL。應(yīng)用熒光定量PCR儀lightcycle 480進行反應(yīng)，反應(yīng)程序如下: 95℃，10 sec;95℃，5 sec;60℃，23 sec;40個循環(huán)。

1.2.6 標準曲線的繪制 為檢測熒光定量PCR檢測體系的檢出限和線性范圍，分別對BmIFV cDNA和含有BmIFV目標核酸片段的質(zhì)粒進行5倍和10倍梯度稀釋，并利用DNA濃度和Ct值之間的相關(guān)性繪制標準曲線。變量相關(guān)性公式［11］如下:Ct= blog(DNA濃度)+a，其中b是斜率，a是截距。

1.2.7 引物探針特異性驗證 將設(shè)計得到的引物和探針在 NCBI上進行 BLAST驗證(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性驗證及實時熒光定量PCR法特異性驗證結(jié)果

將設(shè)計得到的引物和探針進行BLAST驗證，驗證結(jié)果顯示，不論引物還是探針，與之完全匹配的堿基序列都顯示為“傳染性軟化病病毒”的序列，保證了引物探針的高特異性。

表2 實時熒光定量PCR法特異性驗證

2.2 實時熒光定量PCR法靈敏度驗證

將反轉(zhuǎn)錄得到的單鏈BmIFV cDNA進行5倍梯度稀釋檢測引物探針的靈敏度，結(jié)果顯示，BmIFV cDNA濃度≥3.4 ng/μL時，得到的標準曲線的R2值大于0.99，理論上，該濃度以上的檢測結(jié)果較為可靠(圖1);當把BmIFV cDNA濃度為0.7 ng/μL的檢測結(jié)果也統(tǒng)計在內(nèi)時，R2值降至0.97左右(圖2)，其檢測結(jié)果的可信度有所下降(表3，圖1－2)。此外，我們構(gòu)建了含BmIFV目標核酸片段的質(zhì)粒，將構(gòu)建的含BmIFV目標核酸片段的質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋檢測引物探針的靈敏度，結(jié)果顯示，引物探針對構(gòu)建的含BmIFV目標核酸片段的質(zhì)粒的檢測靈敏度可達到10－3ng/μL，當將構(gòu)建的含BmIFV目標核酸片段的質(zhì)粒稀釋到10－4ng/μL時，Ct值大于35，結(jié)果不可靠(表4，圖3)。

圖1 BmIFV cDNA濃度(cDNA濃度≥3.4 ng/μL)和Ct值相關(guān)性曲線

圖2 BmIFV cDNA濃度(cDNA濃度≥0.7 ng/μL)和Ct值相關(guān)性曲線

表3 實時熒光定量PCR法對BmIFV cDNA檢測的靈敏度

表4 實時熒光定量PCR法對質(zhì)粒檢測的靈敏度

圖3 含BmIFV目標核酸片段的質(zhì)粒DNA濃度和Ct值相關(guān)性曲線

2.3 浙江省內(nèi)5個蠶區(qū)的BmIFV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

由表5可知，2015年春季和秋季，分別從浙江省的嘉興市秀洲區(qū)、湖州市南潯區(qū)、嘉興市桐鄉(xiāng)市、嘉興市海寧市、杭州市淳安縣等5個蠶區(qū)抽取家蠶樣本共165個(其中3齡和5齡家蠶樣本156個，蠶蛹樣本9個)，用設(shè)計的特異性引物探針進行實時熒光定量PCR檢測。家蠶幼蟲樣本檢測結(jié)果全部為陰性，蠶蛹檢測出陽性樣本6個，綜合檢出率為3.6%。

表5 浙江省的5個蠶區(qū)BmlFV發(fā)病率調(diào)查

3 討論

本試驗建立的BmIFV實時熒光定量PCR方法，與Nb、BmNPV和BmDNV等家蠶易感染的微生物無交叉反應(yīng)，與顯微鏡觀察、血清學(xué)診斷、熒光抗體檢測等方法比較，具有病原特異性好、檢測靈敏度高、操作簡便(無需制備病毒及抗體)等優(yōu)點，可以實現(xiàn)對BmIFV的快速檢測。

在20世紀70年代日本農(nóng)林水產(chǎn)省對家蠶病害損失率的調(diào)查表明，日本農(nóng)戶養(yǎng)蠶的蠶病損失率為1.7%～3.7%，其中軟化病(主要包括家蠶傳染性軟化病和細菌性腸道病)占66.5%～79.8%［13］，從日本養(yǎng)蠶病害流行中可以發(fā)現(xiàn)家蠶傳染性軟化病是一個重要的病種。2004年和2005年，朱宏杰等［9］用從桐鄉(xiāng)市抽取的家蠶樣本中分離得到的BmIFV毒株制備BmIFV多抗血清，通過用血清學(xué)診斷法對浙江蠶區(qū)進行了較大規(guī)模的BmIFV流行病學(xué)調(diào)查，疑似病蠶的BmIFV檢出率在29%～40%。本次試驗調(diào)查結(jié)果顯示，家蠶病毒性軟化病的總檢出率僅為3.6%，幼蟲樣本未檢出，蠶蛹的檢出率達到66.7%，可能與檢測方法的特異性高、流行病學(xué)調(diào)查的樣本數(shù)量不夠多、家蠶傳染性軟化病的流行和養(yǎng)蠶戶的消毒防病及飼養(yǎng)技術(shù)水平等有關(guān)。

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S884.5+3

B

1007－0982(2016)04－0045－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.011

2016－07－05;接受日期:2016－09－06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號 CARS－22);浙江省重大科技專項(編號20lOCl2005－2);浙江出入境檢驗檢疫局科技項目［編號Zl(2006lO)］。

第1作者信息:董強(1984—)，男，浙江臺州，本科，助理工程師。Tel:0571－81182608，E-mail:baisha122@163.com

信息:吳姍(1976—)，女，浙江杭州，博士，高級工程師。Tel:0571－81100364，E-mail:wss_tea@hotmail.com