T細(xì)胞免疫干預(yù)治療1型糖尿病

劉堯娟，王貫喬，王樹森，2，3（.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津30000；2.天津市第一中心醫(yī)院移植中心，天津 30092；3.天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 30092）

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是一種器官特異性的免疫性疾病，近年來，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)尤其是兒童中處于上升趨勢(shì)。T1DM可能是由于特殊致病基因的改變，一種或多種環(huán)境因素導(dǎo)致，但具體病因仍不能確定。大量研究顯示，T1DM主要發(fā)病機(jī)制是自身免疫性T細(xì)胞攻擊釋放胰島素的β細(xì)胞［1］。T1DM患者依賴于外源性胰島素治療，但常發(fā)生嚴(yán)重的低血糖或胰島素劑量不足而導(dǎo)致的高血糖，疾病后期常發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥（微血管和大血管疾?。┥踔了劳觯?］。

由于T1DM多出現(xiàn)于兒童早期，所以疾病帶來的痛苦將伴隨患者終身，同時(shí)為個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床資料顯示，糖尿病患者糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbAlc）小于7.0%時(shí)可減少微血管和大血管疾病的發(fā)生，但大量臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，僅13%～15%的患者能夠達(dá)到這個(gè)目標(biāo)［3］。近年來，盡管在胰島素種類、動(dòng)態(tài)血糖監(jiān)測(cè)、胰島素泵等方面取得了重大進(jìn)步，再加上嚴(yán)格的代謝控制、規(guī)范的血糖控制（HbAlc＜6.9%），T1DM患者的病死率仍是對(duì)照組的2倍［2，4］。這些研究結(jié)果提示我們，應(yīng)在患者高血糖發(fā)生之前對(duì)其進(jìn)行個(gè)體化干預(yù)或?qū)1DM初發(fā)病患者的剩余胰島細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，更進(jìn)一步，則是通過移植匹配的同種異體胰島、自體干細(xì)胞分化及刺激β細(xì)胞體外增殖等方法，使一些體內(nèi)有很少或幾乎沒有功能性胰島的T1DM患者的β細(xì)胞功能得到修復(fù)［5］。但要長期保存T1DM患者的胰島功能，還需要通過各種免疫干預(yù)方式來抑制其自身免疫反應(yīng)。

1 免疫病理

T1DM是一個(gè)自身免疫過程［6］∶人白細(xì)胞抗原易感基因可能導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）多肽與自身T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合力改變，引起自身反應(yīng)性T細(xì)胞從胸腺逃逸，即無法獲得中樞耐受，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而引發(fā)T1DM［7］。然而在健康對(duì)照組外周血中仍然可以發(fā)現(xiàn)自身反應(yīng)性T細(xì)胞，表明T1DM還存在其他發(fā)病機(jī)制［7］。T1DM的自身免疫過程受遺傳和環(huán)境因素影響［6］，其中外周免疫耐受缺陷是導(dǎo)致此過程的重要因素。外周免疫耐受缺陷由許多原因?qū)е碌?，包括與T1DM相關(guān)的編碼白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-2受體的α亞基、CTLA4和轉(zhuǎn)錄因子FoxP3基因。Coppieters等［8］研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體外周免疫耐受監(jiān)測(cè)點(diǎn)的某些基因缺陷導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化，使胰島受到免疫性攻擊，出現(xiàn)T1DM的特征性病變胰島素炎，誘發(fā)T1DM。

2 免疫干預(yù)靶點(diǎn)

隨著T1DM的免疫病因?qū)W逐漸明確，研究者采用了一些非特異性免疫抑制劑，包括環(huán)孢素、咪唑硫嘌呤和潑尼松等來治療T1DM，盡管有一定的療效，但由于免疫抑制伴隨的嚴(yán)重不良反應(yīng)致使這些臨床試驗(yàn)被終止［9］。中樞及外周的免疫耐受缺陷導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的出現(xiàn)，T細(xì)胞（CD4+和CD8+）被激活，破壞大量胰島β細(xì)胞，使T細(xì)胞成為免疫干預(yù)的重要靶點(diǎn)。在T1DM中效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell，Teff）通過抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的功能導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡。另外，除了常規(guī)的T細(xì)胞外，抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs），包括B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞及T1DM免疫病理學(xué)相關(guān)的可溶性介質(zhì)，也可成為潛在的免疫干預(yù)靶點(diǎn)。隨著對(duì)免疫疾病的深入研究和治療方法的巨大進(jìn)步，尤其是靶向T細(xì)胞、B細(xì)胞及各種細(xì)胞因子表面受體的融合蛋白及單克隆抗體的出現(xiàn)，使靶向免疫干預(yù)治療T1DM成為可能。本文將著重介紹與T細(xì)胞相關(guān)的已經(jīng)應(yīng)用于臨床或可能應(yīng)用于臨床的免疫干預(yù)方法。

3 針對(duì)T細(xì)胞的免疫干預(yù)治療

3.1 共刺激分子阻斷劑∶共刺激分子是T細(xì)胞與抗原首次接觸后，再次被激活的重要信號(hào)，是連接固有免疫和獲得免疫的橋梁。表達(dá)抗原肽-MHC復(fù)合物的APCs與相應(yīng)的T細(xì)胞接觸后，T細(xì)胞表面的TCR可同時(shí)識(shí)別MHC和結(jié)合于MHC分子溝槽里的抗原肽，從而提供T細(xì)胞活化的第一信號(hào)。然而T細(xì)胞激活還需要APCs表面的共刺激分子作為第二信號(hào)，如果沒有共刺激分子，T細(xì)胞將不能活化甚至凋亡。經(jīng)典通路的受體配體是由APCs表面的CD80/CD86（B7-1/B7-2）和天然CD4+和CD8+T細(xì)胞表面的CD28組成。T細(xì)胞被活化后，表面表達(dá)第2種CD80/CD86受體-CTLA4分子，其不同于CD28，具有抑制功能。由于多種共刺激和共抑制信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)，許多具有干預(yù)作用的藥物問世［10-13］。針對(duì)共刺激通路開發(fā)的靶向藥物CTLA4-Ig融合蛋白（阿貝西普）［14］，作為可溶性受體與CD80/CD86結(jié)合，阻斷CD80/CD86-CD28共刺激信號(hào)通路，已被應(yīng)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［15］。治療初發(fā)T1DM的研究表明，阿貝西普治療后，6個(gè)月內(nèi)患者C肽分泌量正常，之后的2年內(nèi)療效較對(duì)照組無顯著差異，另外，對(duì)外周T細(xì)胞亞群進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析，其結(jié)果無明顯變化，但發(fā)現(xiàn)大量初始CD4+T細(xì)胞增殖和中央記憶CD4+T細(xì)胞減少，這同C肽分泌量的結(jié)果相符［16-17］。與我們預(yù)想的一致，盡管反應(yīng)速度比預(yù)期慢，但從治療開始，一些主要調(diào)節(jié)C肽反應(yīng)的Treg數(shù)量出現(xiàn)減少趨勢(shì)，然而Treg控制APCs的功能是通過其細(xì)胞表面CTLA4調(diào)控的這個(gè)機(jī)制并沒有在本實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。盡管如此，阿貝西普通過阻斷共刺激通路治療T1DM這一思路是可行的，并有待進(jìn)行深入研究。同時(shí)，阿貝西普用于預(yù)防T1DM高危人群的試驗(yàn)?zāi)壳耙苍谶M(jìn)行中。

3.2 特異性抗原治療∶針對(duì)免疫耐受治療更有意義的是抗原特異性治療。具體的方案是在自身免疫疾病中對(duì)特異性致病抗原（自身抗原）進(jìn)行有針對(duì)性的特異性治療［18］。如果自身抗原出現(xiàn)在耐受性的環(huán)境中，與耐受性的APCs結(jié)合或結(jié)合相應(yīng)的共抑制信號(hào)，使得自身反應(yīng)性Teff下調(diào)并且伴隨著抗原特異性Treg上調(diào)。由于不需要廣泛的免疫抑制，并且可以反復(fù)進(jìn)行治療，因此，這種治療方案得到了更多研究者的認(rèn)可。

盡管經(jīng)過幾十年來不斷努力，但免疫干預(yù)治療的進(jìn)展并不理想，在一些治療方式中甚至出現(xiàn)患者病情加重的現(xiàn)象［19］。目前，治療所面臨的障礙包括∶治療藥物劑量、臨床路徑、誘導(dǎo)劑、給藥途徑及給藥頻率。由于在T1DM中特異性抗原治療缺乏規(guī)范，近年來治療效果不佳［20］。然而最近一項(xiàng)關(guān)于DNA質(zhì)粒編碼胰島素原的初期研究結(jié)果顯示，在1～4次劑量治療中，15周內(nèi)C肽的分泌量沒有變化，此后C肽的分泌量較對(duì)照組無顯著差異，且發(fā)現(xiàn)C肽的數(shù)量保留與胰島內(nèi)特異性CD8+T細(xì)胞浸潤減少有很大相關(guān)性［21］。盡管這次因?qū)嶒?yàn)樣本過少無法得出令人信服的結(jié)論，但此結(jié)論卻給我們很大的提示∶如果在T1DM治療中給予合適的劑量，可能會(huì)得到令人滿意的結(jié)果。特異性抗原治療還包括聯(lián)合其他藥物治療需要完成［22］。

3.3 T細(xì)胞耗竭∶早期免疫干預(yù)治療中，用抗胸腺細(xì)胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）聯(lián)合激素治療初診斷的T1DM，在改善患者HbAlc水平和減少胰島素用量方面取得了很好的療效［23］，但經(jīng)過12個(gè)月的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ATG治療組并未出現(xiàn)顯著的治療效果，并且研究數(shù)據(jù)顯示ATG治療組C肽分泌量前6個(gè)月較后6個(gè)月有加速減少的跡象［24］。在干預(yù)治療過程中發(fā)現(xiàn)，所有研究對(duì)象在給藥7～10天后釋放細(xì)胞因子，血清中短暫出現(xiàn)大量IL-6和急性蛋白反應(yīng)，表明存在負(fù)向免疫調(diào)節(jié)。另有研究表明，進(jìn)一步免疫活化是T1DM惡化的機(jī)制，需通過IL-2聯(lián)合雷帕霉素進(jìn)行治療［25］。

3.4 T細(xì)胞調(diào)節(jié)∶在T1DM或大多數(shù)自身免疫性疾病中，為了盡量保持Treg和Teff的平衡，一種方法是耗竭相關(guān)自身反應(yīng)性Teff；另一種方法是通過調(diào)節(jié)Teff，使其處于低反應(yīng)狀態(tài)，如提高T細(xì)胞的無效性、耗竭或早衰［26］。通過阻斷共刺激通路導(dǎo)致T細(xì)胞無效反應(yīng)也是一種干預(yù)手段。合理有效的干預(yù)應(yīng)該是耗竭Teff或使其無反應(yīng)性與增強(qiáng)Treg的功能有效結(jié)合［22］。

在初診斷的T1DM中，可通過T細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，CD3單克隆抗體即TCR復(fù)合物的一部分來維持C肽的分泌。Herold等［27］在初發(fā)病的T1DM患者中應(yīng)用Fc無鏈?zhǔn)荏whOKT3γ1（Ala-Ala）抗CD3抗體（后來命名為teplizumab），發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)C肽功能、降低HbAlc水平和胰島素用量的作用。該研究結(jié)論同樣被一個(gè)歐洲團(tuán)隊(duì)用另一種抗CD3抗體（otelixizumab）證實(shí)［28］。這 2個(gè)團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果均表明，CD3抗體在部分患者中的治療效果可以維持3年以上［29-30］。然而相當(dāng)一部分接受此種治療方式的患者在服藥期間出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征和EB病毒活化或EB病毒相關(guān)的疾?。?1］，隨后大量實(shí)驗(yàn)都以失敗告終，部分原因是選擇劑量過低［32-33］。這些結(jié)果令人惋惜但也為免疫干擾的進(jìn)一步研究提供了必要線索。

在Teplizumab的2期臨床試驗(yàn)中，接受第2次藥物治療12個(gè)月后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者的C肽分泌維持了24個(gè)月，這可能是由于抗體阻斷自身免疫從而誘導(dǎo)早期T1DM耐受，即部分治療有效的患者C肽能夠得到非常好的保護(hù)，而治療無效的患者則觀察不到任何變化［34］。然而Teplizumab的基礎(chǔ)藥物反應(yīng)和活性機(jī)制尚不清楚。在早年的研究中，特別是在非肥胖糖尿病動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，CD3抗體治療可以選擇性耗竭致病性T細(xì)胞同時(shí)保護(hù)Treg，但這一機(jī)制并沒有在人類研究中得到驗(yàn)證［35］。研究發(fā)現(xiàn)，治療有效的患者CD4+/CD8+T細(xì)胞比值下降［27，29］，與最近發(fā)現(xiàn)的延期治療患者（非初發(fā)病的T1DM患者）中央記憶性CD8+T細(xì)胞升高的結(jié)果一致［36］。盡管CD8+T細(xì)胞總數(shù)增加與預(yù)期不符，但這可能暗示抗CD3有部分激動(dòng)效應(yīng)，誘導(dǎo)不同類型Teff的調(diào)控。

最近，另一種治療初發(fā)T1DM的T細(xì)胞調(diào)節(jié)藥物阿法賽特正在評(píng)估。阿法賽特是一種針對(duì)T細(xì)胞的靶向CD2共刺激通路的LFA3-Ig融合蛋白。CD2在大部分淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，但在Teff和記憶性T細(xì)胞表面不表達(dá)。早期關(guān)于銀屑病的研究發(fā)現(xiàn)，阿法賽特能夠選擇性的靶向作用于效應(yīng)性記憶T細(xì)胞，其機(jī)制可能與T細(xì)胞亞群部分耗竭，調(diào)控CD2介導(dǎo)的共刺激通路有關(guān)［37］。在銀屑病的治療中，2次或多次使用阿法賽特治療后病情能夠得到長期緩解，這可能是免疫耐受的一種形式［38］。初發(fā)病的T1DM用阿法賽特進(jìn)行了2次12周的療程，發(fā)現(xiàn)C肽保留、胰島素用量顯著下降，且與對(duì)照組相比，12個(gè)月內(nèi)嚴(yán)重低血糖的發(fā)生率降低了50%，這提示對(duì)于初發(fā)病的T1DM患者來說，應(yīng)用阿法賽特治療可緩解病情［39］。

通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)阿法賽特治療組的T細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，中央和效應(yīng)性記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞顯著減少，Treg得到保存，Treg/Teff比值顯著升高，臨床療效明顯。值得關(guān)注的是阿法賽特誘導(dǎo)T細(xì)胞改變的現(xiàn)象，包括降低T細(xì)胞的無反應(yīng)性和/或部分興奮作用，這些都已經(jīng)在人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monouclear，PBMC）［40］的體外試驗(yàn)中得到證實(shí)。由于沒有發(fā)生哺乳動(dòng)物相關(guān)的嚴(yán)重不良事件，阿法賽特可能是一種合適作用于T1DM患者甚至兒童患者的干擾免疫調(diào)節(jié)治療藥物［39］。

3.5 Treg的增殖∶早期報(bào)道表明，可通過減少Teff或增加Treg來改善自身免疫疾病中的免疫平衡。雷帕霉素聯(lián)合IL-2治療初發(fā)病T1DM的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組外周Treg數(shù)量和pSTAT5信號(hào)表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組［25］。然而，即使存在這些顯著的變化，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)可能由于外周自然殺傷細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞的大量增多和其他形式的免疫活化導(dǎo)致病情迅速惡化（C肽急劇下降）［25］。雷帕霉素在抑制Teff活性的同時(shí)，可能對(duì)β細(xì)胞具有毒害作用或在某些環(huán)境下出現(xiàn)抗耐受性。同時(shí)低劑量IL-2治療T1DM的實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行［41-42］，需探索出不僅能夠使Treg增殖還能夠抑制Teff活化的應(yīng)用劑量。

另一種增加Treg的方法是通過移植自體擴(kuò)增Treg。近年來，這種方法已受到廣泛關(guān)注，并且正在應(yīng)用于T1DM的治療中［43］。最近報(bào)道表明，初發(fā)病的T1DM患者輸注自體Treg，部分患者C肽保留超過1年［44-45］，但現(xiàn)階段此干預(yù)方式的有效性和安全性仍不能肯定。目前，人們更關(guān)心的是Treg的穩(wěn)定性和可塑性［46］及在自身免疫環(huán)境中Treg向Teff致病性轉(zhuǎn)化的潛能［47］。為保證Treg輸注后的穩(wěn)定性，必須同時(shí)服用IL-2以提高其穩(wěn)定性和抑制功能。

4 總 結(jié)

通過對(duì)相關(guān)研究的總結(jié)和分析，我們已經(jīng)對(duì)T1DM的免疫機(jī)制有了深刻的了解，也更詳細(xì)的了解了通過T1DM免疫機(jī)制進(jìn)行的免疫干預(yù)療法，包括免疫干預(yù)的靶向識(shí)別、非特異性免疫抑制藥物的臨床研究、靶向生物制劑甚至細(xì)胞治療的研發(fā)和應(yīng)用等，其中一些干預(yù)有潛力應(yīng)用于臨床治療中。應(yīng)更加強(qiáng)調(diào)根據(jù)機(jī)制進(jìn)行免疫耐受的藥物聯(lián)合應(yīng)用，同時(shí)β細(xì)胞在T1DM中的作用也需要受到重視。

不同于干細(xì)胞或者藥物誘導(dǎo)細(xì)胞再生，一旦免疫耐受被重新恢復(fù)，長期保留剩余的β細(xì)胞或保持移植后β細(xì)胞接近正常水平將可以實(shí)現(xiàn)。鑒于以上諸多原因，進(jìn)一步優(yōu)化免疫干預(yù)方式將成為今后T1DM免疫治療研究的重點(diǎn)。