PEG脅迫對萌動苦豆子子葉抗旱生理及氧化苦參堿含量的影響

劉　丹，王　雪，楊　毅，段啟榮，李亞斌，劉　晶，劉　萍

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 寧夏 銀川 750021)

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PEG脅迫對萌動苦豆子子葉抗旱生理及氧化苦參堿含量的影響

劉丹，王雪，楊毅，段啟榮，李亞斌，劉晶，劉萍

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 寧夏 銀川 750021)

摘要：以PEG-6000模擬干旱條件，測定苦豆子種子萌發(fā)、萌動種子子葉中質(zhì)膜相對透性(PMP)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量以及抗氧化物酶POD、CAT、SOD酶活性以及氧化苦參堿含量，探討苦豆子種子的抗旱適應(yīng)性。結(jié)果表明：10% PEG脅迫下，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均達到最高，依次為66.67%，78.67%，24.40和183.79，20% PEG脅迫種子仍有較高的發(fā)芽能力。隨PEG脅迫程度加劇，萌動苦豆子種子子葉中質(zhì)膜相對透性和Pro含量逐漸上升，MDA含量逐漸下降；POD、CAT和SOD 3種保護酶對干旱脅迫的保護作用不盡相同，中輕度脅迫(PEG≤20%)時POD酶起主要作用，重度脅迫(PEG>20%)時CAT和SOD酶起主要作用。PEG脅迫使子葉中OMA含量下降，OMA含量與抗旱生理指標間均存在負相關(guān)。適度干旱有助于苦豆子種子萌發(fā)，萌動種子對干旱有強的防御機制。

關(guān)鍵詞：苦豆子；萌動種子；PEG脅迫；抗旱生理；氧化苦參堿

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)是豆科槐屬多年生草本植物[1]，主要生長于沙質(zhì)土壤中，耐沙埋、抗風蝕，具有良好的沙生特點，在寧夏的鹽池、靈武、陶樂等沙漠和荒漠地區(qū)有較豐富的資源，是寧夏自然植被的重要組成部分[2]?？喽棺游稑O苦，具有清熱解毒、抗菌消炎、止痛殺蟲等作用[3]。苦豆子中用于藥物開發(fā)的主要有氧化苦參堿(Oxymatrine，OMA)，苦參堿(Matrine，MA)，槐果堿(Sophocarpine)和氧化槐果堿(Oxysophocarpine)等多種生物堿[4]。有研究認為氧化苦參堿有抗乙型肝炎病毒、抗肝纖維化的藥理作用，是治療慢性乙型肝炎的常用藥物[5-6]，還能抑制細胞生長和在體外誘導(dǎo)細胞凋亡[7]。由于苦豆子較高的生態(tài)功能和藥用價值，苦豆子資源的合理保護與開發(fā)利用越來越受到人們的重視，寧夏回族自治區(qū)將苦豆子列入重點保護的六大地道藥材之一，納入國家中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)行動計劃中，生產(chǎn)基地建設(shè)和深層次領(lǐng)域開發(fā)都有長足的發(fā)展[8]。

種子萌發(fā)是植物生長的重要階段，不僅受到自身遺傳物質(zhì)的控制，還受干旱、高溫、鹽堿等環(huán)境因子的影響，其中干旱脅迫影響植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，嚴重影響植物的生長、發(fā)育和繁殖等生命活動[9-11]。章炳醒等[12]研究認為干旱脅迫影響黃檗幼苗的生理性狀及葉片中小檗堿含量，王進等[13]認為PEG脅迫導(dǎo)致苦豆子種子的吸脹速率、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、苗高和根長、組織飽和含水量等指標明顯降低，而苗干重、根干重和根冠比呈先升后降，表明干旱是影響苦豆子種子萌發(fā)和幼苗生長主要的非生物脅迫因子之一。段啟榮等[14]認為干旱脅迫使得苦豆子幼苗葉片質(zhì)膜相對透性增高，長時間重度脅迫促使脯氨酸含量顯著增加；POD、CAT和SOD三種保護酶先后交替發(fā)揮作用，苦豆子幼苗對干旱脅迫表現(xiàn)出較強的適應(yīng)能力。然而對干旱脅迫條件下苦豆子種子萌發(fā)階段與抗旱相關(guān)的生理特性和氧化苦參堿含量的系統(tǒng)性研究還鮮見報道，本文以PEG模擬干旱環(huán)境研究苦豆子種子在干旱條件下的萌發(fā)、萌發(fā)種子子葉的生理活性及氧化苦參堿含量變化，旨在探討干旱脅迫條件下萌動苦豆子種子各項抗旱生理指標的動態(tài)變化規(guī)律以及與氧化苦參堿含量之間的關(guān)系，為揭示苦豆子的抗旱機制和苦豆子的人工栽培以及幼苗培育提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

苦豆子莢果采自寧夏永寧縣楊和鄉(xiāng)(106°144′，38°138′)，經(jīng)自然干燥后脫粒精選飽滿的子粒，種子用98% H2SO4處理20 min以破除硬實，清水反復(fù)沖洗后晾干備用。

1.2種子萌發(fā)

用質(zhì)量分數(shù)5%、10%、15%、20%、25%、30% PEG溶液模擬干旱脅迫，以去離子水為對照處理苦豆子種子，每脅迫處理3個重復(fù)，各處理隨機取100粒種子于培養(yǎng)皿(φ=15 cm)內(nèi)，加入適量處理溶液后加蓋，25℃恒溫培養(yǎng)。為減少種子吸水引起培養(yǎng)皿內(nèi)水勢的變化，每12 h更換一定量PEG處理液。第3天測定發(fā)芽勢，第7天測定發(fā)芽率，發(fā)芽種子的鮮重、胚根長、胚根粗和干重等的稱量參見陽翠等[15]的方法，分別計算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。發(fā)芽指數(shù)(GI)=Σ(Gt/Dt)(其中Gt表示第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))；活力指數(shù)(VI)=S×GI(式中S為幼苗鮮質(zhì)量重，GI為發(fā)芽指數(shù))[16]。

用于萌動種子生理活性測定和氧化苦參堿提取的種子萌發(fā)過程如下：取苦豆子種子在25℃恒溫箱中萌發(fā)，挑出剛露白的種子，分別以5%，10%，15%，20%，25%，30% PEG溶液模擬干旱脅迫處理已萌動的苦豆子，以去離子水為對照，重復(fù)3次，余下處理同上。經(jīng)脅迫處理72 h的萌動種子，迅速去除種皮剪取子葉，蒸餾水漂洗幾次后吸干殘留水分，精確稱取0.5 g，液氮冷凍，-70℃保存用于測定各生理指標(電導(dǎo)率和MDA含量直接用鮮樣測定)；其余子葉于80℃烘箱中烘干，用于氧化苦參堿(OMA)的提取。

1.3萌動種子生理活性測定方法

電解質(zhì)外滲量法測定質(zhì)膜相對透性(Plasma membrance permeability, PMP)[17]，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量[17]，茚三酮顯色法測定脯氨酸(Pro)含量[17]，紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性[17]，氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[17]，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[18]。

1.4萌動種子氧化苦參堿的提取和含量的測定

精確稱取干燥苦豆子子葉粉末0.20 g于錐形瓶中，分別加入1.0 mL氨水、20 mL三氯甲烷，搖勻，浸潤12 h后超聲提取40 min，取15 mL提取液經(jīng)中性氧化鋁小柱過濾，并用10 mL氯仿∶甲醇(7∶3)混合液清洗氧化鋁小柱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶液，殘渣用50%甲醇超聲溶解并定容至10 mL，4 000 r·min-1離心10 min。上清液過Φ 0.2 μm濾膜后即為待測樣品。

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測器，島津LC-solution工作站，檢測波長210 nm，柱溫30℃，流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液(0.035∶0.965)，進樣量10 μL，流速1 mL·min-1。將濃度為595.000 μg·mL-1的氧化苦參堿標準品分別稀釋 0，2，4，8，16，32倍，按上述色譜條件分別測定，以峰面積A為縱坐標對濃度C為橫坐標作圖，得回歸方程：A=1×107C+49646，r=0.9993，氧化苦參堿濃度范圍為18.594～595.000 μg·mL-1。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用DPS 6.0軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析，Duncan 法多重比較，Excel繪圖，不同小寫字母表示顯著性差異(P≤0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1PEG脅迫對苦豆子種子萌發(fā)的影響

隨著PEG處理濃度的增加，苦豆子種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽種子鮮重、胚根長、胚根粗等均表現(xiàn)為先升高再下降(表1)，10% PEG脅迫下種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都達到最高。方差分析表明，在較高濃度PEG(>20% PEG)脅迫下除發(fā)芽率外與發(fā)芽相關(guān)的其余指標和對照相比均存在顯著差異，高濃度PEG嚴重影響苦豆子種子萌發(fā)。

2.2PEG脅迫對萌動苦豆子子葉生理特性的影響

隨PEG濃度的增加，萌動苦豆子種子子葉PMP和Pro含量表現(xiàn)為上升(表2)，5%以上的PEG脅迫，就足以引起PMP的顯著改變(P≤0.05)，而Pro含量的顯著增加(P≤0.05)則需要重度脅迫(PEG≥25%)。5% PEG脅迫下MDA含量最高，隨脅迫的加劇，MDA含量逐漸下降(P≤0.05)，但均高于CK。CAT和SOD活性在輕度脅迫(PEG≤10%)下均略有下降，在中、重度脅迫(PEG≥15%)下，兩者的活性有所上升，但各處理組CAT活性與CK無顯著差異，而SOD酶在中、重度脅迫下的活性卻顯著高于輕度脅迫下的活性(P≤0.05)，是其7.6～13.0倍。POD活性表現(xiàn)為先上升再下降的趨勢，15% PEG脅迫下POD酶活性達到最大，隨后迅速降低，30% PEG脅迫下POD酶活性最低且小于CK。

2.3PEG脅迫對萌動苦豆子子葉氧化苦參堿含量的影響

干旱脅迫使萌動苦豆子子葉中OMA含量發(fā)生變化。在15% PEG脅迫下，子葉中OMA含量降到最低，與CK差異顯著(P≤0.05)，但20%的PEG脅迫卻使OMA含量上升，且是各實驗組中最大，雖略低于CK，但與其無顯著差異；在PEG重度脅迫下，OMA的含量明顯下降(圖1)。

圖1PEG脅迫萌動苦豆子種子后子葉中氧化

苦參堿含量的變化

Fig.1The content of oxymatrine under PEG stress in

cotyledon ofS.alopecuroidesgerminating seeds

2.4萌動苦豆子子葉生理活性與氧化苦參堿含量的關(guān)系

研究顯示萌動苦豆子種子經(jīng)PEG脅迫后，其子葉中質(zhì)膜透性與Pro含量、SOD酶活性顯著正相關(guān)，Pro含量與CAT活性極顯著正相關(guān)，SOD、POD活性與CAT活性顯著正相關(guān)；OMA含量與膜透性、Pro和MDA含量、SOD，POD和CAT活性間都存在負相關(guān)關(guān)系，但差異不顯著(表3)。

3討論

苦豆子種子在10% PEG溶液中，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等都達到最高，說明適度的干旱對苦豆子種子萌發(fā)具有較好的引發(fā)作用，苦豆子在20% PEG的脅迫下，依然具有較高的萌發(fā)能力，說明苦豆子種子在萌發(fā)過程中對干旱有一定的耐受性。

本研究中萌動苦豆子在5% PEG的輕度脅迫下，子葉中MDA含量達到最大，說明萌動的苦豆子種子對干旱脅迫較為敏感，但對更高程度的干旱脅迫卻能夠迅速做出響應(yīng)，因而伴隨脅迫的加劇，MDA含量不是升高，反而有所下降，即使是在重度脅迫下，其含量也沒有超過5% PEG脅迫；此外，PEG脅迫后，子葉中PMP有所增高，除30% PEG脅迫外，各脅迫處理的PMP和對照無顯著差異，這些研究均顯示苦豆子對干旱有極強的防御機制，使其對細胞膜的傷害降到最低，這一點在保護性物質(zhì)Pro隨脅迫程度增加含量上升也得到印證。

注(Note): *,P≤0.05；**,P≤0.01。

CAT、SOD和POD等是細胞抵御活性氧傷害的重要保護酶，在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物以及阻止或減少自由基產(chǎn)生等方面起著重要作用[19]。但這三種保護酶對干旱脅迫反應(yīng)的靈敏程度不同，因而對逆境下苦豆子的保護作用也有所不同。輕度脅迫下，CAT和SOD保護酶基本不起作用，其酶活性不但不增加反而略有下降，但POD保護酶對中、輕度干旱脅迫反應(yīng)迅速，酶活性是CK的1.6～2.5倍。研究認為萌動苦豆子種子在受到中、輕度干旱脅迫時POD保護酶起主要作用，在受到重度干旱脅迫時CAT和SOD保護酶則起主要作用。

相關(guān)分析顯示與抗旱相關(guān)的各項生理指標間表現(xiàn)出顯著或極顯著正相關(guān)，但各指標與OMA含量均表現(xiàn)為負相關(guān)，說明這些生理指標在苦豆子種子萌發(fā)過程中能夠協(xié)同抵御干旱脅迫，同時苦豆子種子在萌發(fā)過程中較高的抗旱性是以減少次生代謝產(chǎn)物積累為代價的；PEG脅迫使子葉中OMA含量下降，可能與干旱促使種子在萌動過程中加速消耗其部分生物堿以減少對其生長影響有關(guān)，因此，為使苦豆子種子獲得較高產(chǎn)量的OMA，在人工栽培條件下，在種子成熟期應(yīng)給予適當?shù)乃盅a充。

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Influence of PEG stress on cotyledons physiology and oxymatrine content in germinating seeds ofSophoraalopecuroides

LIU Dan, WANG Xue, YANG Yi, DUAN Qi-rong, LI Ya-bin, LIU Jing, LIU Ping

(CollegeofAgronomy,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia750021,China)

Keywords:Sophoraalopecuroides; germinating seed; PEG stress; cotyledons physiology; oxymatrine

Abstract：The drought resistance and physiological characteristic and oxymatrine (OMA) content ofSophoraalopecuroidesgerminating seed were investigated under the simulation drought stress by PEG-6000. The results showed that germinating energy, germinating percentage, germinating index, and seeds vigor index ofS.alopecuroidessimultaneously reached maximum at 10% PEG, with maximum value of 66.76%，78.67%, 24.40, and 183.79 respectively. Meanwhile, at 20% PEG stress, significant germinating capability was still detected in germinating seed ofS.alopecuroides. With increasing PEG stress, the relative permeability of plasma membrane and proline content increased gradually, while malonaldehyde (MDA) content in cotyledon ofS.alopecuroidesgerminating seed decreased. It was found that the protecting mechanisms of peroxidase (POD), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) forS.alopecuroidesgerminating seed under PEG stress varied, with POD playing major role under mild stress (PEG≤20%) but CAT and SOD under severe stress (PEG>20%). OMA content in cotyledons ofS.alopecuroidesgerminating seed decreased with higher PEG stress and OMA content was found to be negatively correlated with relative permeability of plasma membrane, proline and MDA content, and activities of SOD, POD and CAT. These results indicate that moderate drought stress is helpful toS.alopecuroidesat seed germination stage.

文章編號：1000-7601(2016)03-0165-04

doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2016.03.26

收稿日期：2015-09-10

基金項目：寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ14033)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(131074909)

作者簡介：劉丹(1990—)，女，寧夏中衛(wèi)人，學(xué)士，主要從事植物種質(zhì)資源研究。E-mail：yichuanyuzhong@126.com。 通信作者：劉萍(1961—) ，女，上海人，教授，主要從事植物種質(zhì)資源研究。E-mail：liupnxdx@126.com。

中圖分類號：Q945.34； S567.2

文獻標志碼：A