規(guī)模化鵝場(chǎng)發(fā)生多種血清型鴨疫里默菌的混合感染

羅雪剛，夏文君，李　閣，羅永芳，彭少靜，周　念，李繼祥（.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌40460；.重慶永健生物技術(shù)有限公司，重慶　榮昌40460）

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規(guī)?；Z場(chǎng)發(fā)生多種血清型鴨疫里默菌的混合感染

羅雪剛1，夏文君1，李閣2，羅永芳1，彭少靜1，周念1，李繼祥1
（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460；2.重慶永健生物技術(shù)有限公司，重慶榮昌402460）

鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）為革蘭陰性小桿菌、無(wú)芽孢、不能運(yùn)動(dòng)、有莢膜，主要感染家鴨、鵝、火雞，但也有感染雞的報(bào)道[1]。該細(xì)菌血清型復(fù)雜且缺乏交叉免疫保護(hù)、耐藥性嚴(yán)重，導(dǎo)致疾病難以預(yù)防和治療。2014年5月中旬，重慶榮昌縣某規(guī)?；Z場(chǎng)的18日齡鵝發(fā)病，21日齡時(shí)發(fā)病率約為30%、死亡率為10%左右，病死鵝表現(xiàn)為典型的心包炎、肝周炎和氣囊炎。經(jīng)西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)室診斷，該病為多血清型鴨疫里默菌混合感染，現(xiàn)將病例診斷結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1病例重慶榮昌縣某規(guī)?；Z場(chǎng)飼養(yǎng)的肉用四川白鵝5 000余只，18日齡鵝發(fā)病，病鵝精神沉郁、食欲下降、羽毛蓬松、呼吸困難，眼鼻分泌物增多、糞便稀薄呈綠色，腿軟弱、跗關(guān)節(jié)腫大、腿部皮溫明顯高于體溫，臨死前表現(xiàn)為頭頸扭斜、抽搐等神經(jīng)癥狀。發(fā)病鵝采用網(wǎng)上平養(yǎng)、密度適中、未免疫鴨疫里默菌疫苗、未使用抗菌藥物，鵝苗購(gòu)自四川隆昌縣禽苗市場(chǎng)。2只送檢病鵝均表現(xiàn)為心包炎、肝周炎和氣囊炎，脾臟腫大，腦膜充血、出血。

1.2細(xì)菌分離鑒定利用巧克力和麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板從送檢鵝的肝、腦組織分離細(xì)菌，典型菌落純培養(yǎng)后從細(xì)菌形態(tài)、生化特性和鴨疫里默菌cam基因檢測(cè)[2]等方面進(jìn)行鑒定。

1.3病毒檢測(cè)病死鵝肝組織勻漿反復(fù)凍融3次后離心上清液利用病毒RNA/DNA快速提取試劑盒（TaKaRa產(chǎn)品）提取RNA/DNA用于小鵝瘟[3]、禽流感[4]和鴨甲肝病毒[5]檢測(cè)。

1.4鴨疫里默菌血清鑒定雞抗鴨疫里默菌血清（1型、2型、4型、8型和14型），自制，-80℃保存[6]。將分離鑒定的鴨疫里默菌用巧克力平板純培養(yǎng)，按張大丙（1999）[7]報(bào)道的玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定。

1.5體外藥敏試驗(yàn)藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，藥敏試驗(yàn)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)鑒定為鴨疫里默菌的分離菌株用巧克力平板培養(yǎng)（37℃、24 h），生理鹽水懸浮，測(cè)定細(xì)菌數(shù)。14日齡健康鴨每只腿部肌肉接種約1×108CFU/0.2 mL的菌懸液，連續(xù)7 d觀察發(fā)病死亡情況，死亡病鴨進(jìn)行剖檢與細(xì)菌回歸試驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌分離鑒定病死鵝肝和腦組織劃線接種巧克力培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后有表面光滑、稍突起的露珠狀菌落形成；用麥康凱平板沒(méi)有分離出細(xì)菌；利用RT-PCR或PCR沒(méi)有從病死鵝肝組織中檢測(cè)到小鵝瘟病毒、禽流感病毒和鴨甲肝病毒。單菌落純培養(yǎng)物染色鏡檢為革蘭陰性小桿菌、無(wú)鞭毛和芽孢；瑞氏染色呈菌體兩極濃染。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株能液化明膠、不發(fā)酵糖、不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫、不還原硝酸鹽，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。利用鴨疫里默菌cam基因的特異性引物對(duì)分離菌的基因組DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)為1 000 bp左右的單一DNA條帶。

2.2血清型鑒定從每只送檢鵝肝、腦組織劃線分離的細(xì)菌中隨機(jī)挑取5個(gè)菌落純培養(yǎng)，經(jīng)鑒定為鴨疫里默菌后用于血清型鑒定。從第1只鵝腦組織分離的5株鴨疫里默菌中血清2型3株、血清4型2株；從肝臟分離的細(xì)菌中血清2型2株、血清4型2株和未定型1株。從第2只鵝分離10株細(xì)菌中，除分離于腦的1株細(xì)菌為血清14型外，其余均為血清4型。

2.3細(xì)菌體外藥敏試驗(yàn)從鑒定血清型的20株鴨疫里默菌中選取8株細(xì)菌進(jìn)行的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。分離菌株對(duì)阿莫西林的敏感性好，多數(shù)菌株對(duì)頭孢曲松、羅紅霉素等的敏感性差，甚至完全耐藥。同時(shí)從表1可知，分離于同一只病鵝的相同血清型菌株間的耐藥性存在明顯差異，如分離于第1只病鵝腦組織的血清2型菌株（菌株1）對(duì)恩諾沙星耐藥（11.8 mm），而分離于肝組織的（菌株3）則敏感（18.0 mm）。

2.4致病性試驗(yàn)測(cè)定藥物敏感性的8株細(xì)菌1×108CFU/0.2 mL都能在24～36 h內(nèi)引起14日齡接種鴨發(fā)病、在48～60 h內(nèi)發(fā)生死亡、在120 h內(nèi)100%（7/7）死亡。病死鴨剖檢大體病變?yōu)榈湫偷男陌?、肝周炎和氣囊炎；都能從腦和肝臟組織中分離出與接種細(xì)菌相同血清型的鴨疫里默菌。

表1　體外藥物敏感性試驗(yàn)抑菌圈的直徑（mm）及敏感性判定

3　討論

鴨疫里默菌感染鵝發(fā)病的病例報(bào)道較多，但同一鵝群存在多種血清型菌株感染，甚至從同一只病死鵝中分離鑒定出3種血清型菌株的病例未見(jiàn)報(bào)道。從細(xì)菌分離鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)和血清鑒定等確診重慶榮昌某規(guī)?；Z場(chǎng)18日齡鵝發(fā)病是由4種血清型的鴨疫里默菌混合感染所致。在病例診斷中，從病理剖檢的第1只病死鵝組織中分離鑒定出3種血清型（2型、4型和未定型）鴨疫里默菌，第2只中鑒定出2種（4型和14型）；不同菌株的藥物敏感性有差異，即使是分離于同一病死鵝的同一血清型的不同菌株間也存在明顯的差異。鴨疫里默菌多血清型菌株混合感染鵝群的原因在于：種鵝的小規(guī)模飼養(yǎng)，雛鵝來(lái)源多樣化；雛鵝在禽苗市場(chǎng)集中交易導(dǎo)致交叉感染；飼養(yǎng)場(chǎng)沒(méi)有實(shí)行全進(jìn)全出及嚴(yán)格的消毒，污染嚴(yán)重；養(yǎng)鵝場(chǎng)附近存在養(yǎng)鴨場(chǎng)，有從鴨傳染鵝的可能。

疫苗免疫預(yù)防和抗菌藥物防治是控制鴨疫里默菌感染的2種途徑，由于同一群體中存在多血清型菌株感染，且藥物敏感性不一致，這使得生產(chǎn)實(shí)際中藥物和疫苗的效果難以保證。因此，對(duì)于鴨疫里默菌感染的控制應(yīng)采用全面實(shí)施生物安全措施的策略。

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通訊作者：李繼祥，E-mail：jixianglucky@126.com

作者簡(jiǎn)介：羅雪剛（1990-），男，博士生，主要從事動(dòng)物疾病的診斷研究，E-mail：122453213@qq.com

收稿日期：2014-06-13

中圖分類號(hào)：S852.61+8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0052- 02