簡易方法制備復合蛋白酶樣品

霍雨霞薩玉龍楊相政

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術學院，內蒙古呼倫貝爾021000；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

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簡易方法制備復合蛋白酶樣品

霍雨霞1薩玉龍1楊相政2

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術學院，內蒙古呼倫貝爾021000；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

摘要：本實驗在幾種常見蛋白酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶）單酶水解效果比較基礎上，按一定比例配制復合酶進行水解，通過測定水解液的水解度、透光度和過濾速度檢測水解效果，得出水解效果最優(yōu)的復合蛋白酶，結果表明該方法操作簡單，應用試驗效果明顯。此方法適合應用研發(fā)能力較弱、實驗設備簡單的中小型酶制劑企業(yè)簡易制備復合蛋白酶樣品，在短時間內給客戶提供酶制劑樣品。

關鍵詞：復合蛋白酶；應用研發(fā)；樣品

蛋白酶來源豐富，除從動、植物中提取外，還可由細菌大量發(fā)酵生產，已廣泛應用于醫(yī)療、食品、制革、繅絲等工業(yè)，也可作為重要的生化試劑[1,2]。例如木瓜或菠蘿蛋白酶用作啤酒穩(wěn)定劑，能消除由于啤酒冷藏而產生的蛋白質沉淀等。酶解法是一種新興的動物蛋白生產方法，因酶解法優(yōu)點較多，很多食品企業(yè)已廣泛采用。

由于酶的催化具有專一性，使得單酶不符合許多工藝要求，因此復合酶的使用無疑是酶制劑行業(yè)的必然趨勢[3]。目前我國酶制劑工業(yè)主要存在的問題是復合酶制劑的應用開發(fā)力度不夠[4]，制約了酶制劑企業(yè)的市場開拓能力，尤其是中小型酶制劑企業(yè)，無法擔負高額的試驗研發(fā)設備和檢測設備，危及企業(yè)自身的生存和發(fā)展。因此，盡快提高復合酶應用技術，努力提高產品結構，是許多中小型酶制劑企業(yè)必經之路。

本文以水解豬肉蛋白為例，在單酶水解基礎上，采用三種常用蛋白酶配制復合蛋白酶，測定水解液的水解度、透光度、過濾速度等，檢測復合酶水解效率，從而快速制備水解豬肉蛋白的復合蛋白酶樣品，試驗方法簡單，應用效果顯著，可視為企業(yè)根據(jù)簡單的應用試驗效果，在短時間內配制酶制劑樣品較好的方法。

1　材料與方法

1.1試驗材料

市售新鮮豬肉餡兒，冷藏備用。

1.2主要試劑

磷酸鹽緩沖液pH 6.81，硼酸緩沖液pH 9.18；

中性蛋白酶（5.0×104IU/g），南寧龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶，肇東市酶制劑廠；

木瓜蛋白酶（2.0×105IU/g），南寧龐博生物工程有限公司。

1.3主要設備

凱氏定氮儀（KDN-04A），上海荊和分析儀器有限公司；

恒溫水浴鍋，電子天平，pHS-25數(shù)顯pH計，上海精密科學儀器有限公司；

WH7410-50B型電動攪拌器，天津市威華儀器設備有限公司；

紫外分光光度計，上海第三分析儀器廠；

TD-4K-6K-10K高速離心機，上海趙迪生物科技有限公司。

1.4測定方法

可溶性蛋白質含量的測定用凱氏定氮法，具體測定方法見參考文獻[5]；

透光度：660nm處透光度T，具體方法見參考文獻6；

水解度（DH）計算公式如下[7]：

過濾速度測定見參考文獻8。

1.5水解工藝流程

1.5.1預處理

室溫下，稱取新鮮豬肉餡兒50g于250mL燒杯中，加水100mL，攪拌均勻，將燒杯置于水浴鍋中，升溫至80～90℃，保溫10min后，將燒杯置于涼水中降溫至40℃，調節(jié)料液pH為7.0。

1.5.2水解條件

在處理好的料液中添加酶，添加量為豬肉餡兒質量的0.3％，置于溫度50～55℃的恒溫水浴鍋中水解，攪拌機（150r/min）勻速攪拌，水解3h后，料液加熱煮沸10min滅酶，靜置冷卻，離心（2000r/min）取上清液，測定水解度、透光度和過濾速度。

1.6復合酶配比

試驗對比5種復合酶水解效果，其組成配比見表1。

2　結果與分析

2.1單酶與復合酶水解效果的比較

2.1.1單酶與復合酶水解度的比較

以中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶單酶水解豬肉蛋白的水解效果作為對照，配制復合酶I號、II號、III號在相同酶解條件下水解3h，每30min測定豬肉蛋白水解液的水解度和透光度以及每10mL水解液的過濾時間，結果見圖1、圖2、圖3。

表1　三種蛋白酶復合酶配比

圖1　單酶與復合蛋白酶水解豬肉蛋白水解度的比較

反應進行60min左右時，單酶和復合酶水解速度相當，當反應進行到90min時，中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶單酶的水解度已經達到60％左右，且隨著水解時間的增加，水解度已經沒有明顯的增加，而90min時，復合蛋白酶I號、II號、III號水解液的水解度分別為78.23％、70.01％、85.49％，尤其是復合蛋白酶III號在反應120min時，水解度為94.22％，與木瓜蛋白酶單酶的水解度相比增加了約35.4％，與復合蛋白酶I號最大水解度相比增加了12.19％，說明復合酶水解效果比單酶水解效果好，且復合酶III號水解效果最好。

2.1.2單酶與復合酶透光度的比較

圖2　單酶與復合蛋白酶豬肉蛋白水解液透光度比較

此外，從圖2可以看出，酶解反應結束后，復合酶III號水解液的透光度最大，為91.30，因此選用復合酶III號進行下一步的試驗。

2.1.3單酶與復合酶過濾速度的比較

圖3　單酶與復合蛋白酶豬肉蛋白水解液過濾速度比較

由圖3可以看出，過濾速度復合酶III（1）最慢，為58s/10mL，因此其水解效果最好。

2.2不同配比的復合酶III號水解效果測定

將不同配比的復合酶III，在相同酶解條件下對豬肉蛋白進行水解3h，每30min測定豬肉蛋白水解液的水解度、透光度和水解液的過濾速度，結果見圖4、圖5、圖6。

圖4　復合酶III號不同配比水解度的比較

圖5　復合酶III號不同配比水解液透光度的比較

從圖4可得出，復合酶III（1）號水解效果優(yōu)于其他三種，當反應進行到120min時，水解度已達94.22％。

根據(jù)圖5、圖6可得出，復合酶III（1）號水解進行3h后，水解液的透光度最高，為91.3％，過濾速度為58s/10mL，與其他幾種配比水解效果相比較，效果最佳。

圖6　復合酶III號不同配比水解液過濾速度的的比較

2.3確定最佳復合蛋白酶制劑樣品

按照以上試驗結果，得出水解效果最佳復合蛋白酶為復合酶III（1）號，其配方為木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:胰蛋白酶=1:1:1，樣品建議添加量為0.3％，水解料液pH 7.0，水解溫度50～55℃，水解時間為3h。

3　結論

1）本試驗所用三種蛋白酶單酶水解效果比均復合酶水解效果差，因此，在具體應用中應重點考慮復合酶制劑水解豬肉蛋白進行下一步試驗。

2）根據(jù)試驗結果得出的水解豬肉蛋白復合酶的優(yōu)選配比為木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：胰蛋白酶=1:1:1，復合酶的添加量為0.3％，水解料液pH 7.0，水解溫度50～55℃，水解3h時，此條件下，水解度最高可達94.22％，水解液透光度為91.3，水解液過濾時間速度為58s/10mL。

參考文獻：

[1]唐婧苗,劉章武,吳紹武,等.解動物蛋白（HAP）的制備及其在食品中的應用[J].武漢工業(yè)學院學報,2009,28(2):26-28.

[2]周小娟.正確認識酶制劑[J].畜牧與飼料科學,2014,35(7): 33-35.

[3]周舒翔,丁平,葛元,等.紡織用酶制劑復配技術研究與進展[J].中國纖檢,2012,11(22):84-88.

[4]第三屆全國酶制劑研究開發(fā)應用技術研討會成功召開[J].食品與發(fā)酵業(yè),2012,38(8):113.

[5]湯高奇,柳艷霞,楊繼.酶法水解動物蛋白工藝研究[J].楊凌職業(yè)技術學院學報,2004,3(4):6-7.

[6]趙妍嫣,姜紹通,陳雄.水解豬肉蛋白制備食用香精的工藝研究[J].食品科學,2009,30(12):40-42.

[7]李小華,吳雨思,于新,等.豬肉蛋白酶法水解工藝優(yōu)化研究[J].甘肅農業(yè)大學學報,2009,2(1):143-146.

[8]王芬.酶制劑的安全性及其在面粉改良中的應用[J].現(xiàn)代面粉工業(yè),2014,28(4):21-22.

The Simple Method of Preparing Compound Proteinase Sample

HUO Yu-xia1SA Yu-long1YANG Xiang-zheng2
(1.Hulunbeier Vocational Technical College,Hulunbeier 021000,China;2.Jinan Fruit Research Institute,All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Took the hydrolysis of pork for example to prepare the compound proteinase sample,the concrete method was that prepared the compound proteinase according to a certain proportion based on the hydrolysis result of single factor test (papain,neutrase,trypsin),then tested the degree of hydrolysis,the transmittance of light and the filtration of hydrolysate to check the results.Prepared the compound proteinase sample according to the results in a short time and supplied with the clients.The results showed that the method was efficient,easy and quick,suitable for small and medium enterprises with simple equipments and short of development capabilities.

Key words:Compound proteinase;development capabilities;sample

作者簡介：霍雨霞（1984—），女，講師，研究方向為農產品加工及貯藏

基金項目：山東省自然科學基金（ZR2014CQ019）

收稿日期：2015-07-08

中圖分類號：TS214

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1038(2016)02-0017-03