種子發(fā)育和萌發(fā)過程的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

李 佳， 陸秀君， 梅 梅，， 張曉林， 馬 躍

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 遼寧 沈陽110866； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 遼寧 沈陽110866）

種子是植物傳播的主要形式和繁殖器官，它貯藏足夠養(yǎng)分以供幼苗生長成為自養(yǎng)體，是子代植株形成的開端［1］。蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，也是生理功能的最終執(zhí)行者，同時(shí)它不僅是種子養(yǎng)料的提供者，也是種子內(nèi)部生化反應(yīng)和代謝過程的調(diào)控者，因此，在種子的形成、發(fā)育、萌發(fā)直至成苗的過程中，蛋白質(zhì)都發(fā)揮著極其重要的作用。隨著擬南芥、水稻等高等植物基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入到功能基因組時(shí)代。目前，功能基因組學(xué)的研究大多是從mRNA水平考慮的，細(xì)胞中mRNA的水平能反映蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。從mRNA到蛋白質(zhì)，包括3個(gè)水平的調(diào)控：轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控和翻譯后水平調(diào)控。然而，mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度并不呈正相關(guān)，尤其對(duì)于一些低豐度蛋白來說，相關(guān)性更差［2－3］。一個(gè)基因?qū)?yīng)的可能不是一種蛋白質(zhì)而是幾種甚至是數(shù)十種。因此完全有必要從蛋白質(zhì)水平上去研究基因的功能。種子生物學(xué)作為植物學(xué)重要分支，隨著高通量分離鑒定技術(shù)的發(fā)展，特別是種子蛋白質(zhì)組門戶網(wǎng)站 （SPWP；http：／／www.seed－proteome.com／）的 建立［4］，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為基因功能分析的有利工具，越來越多地應(yīng)用于種子發(fā)育、休眠、破眠以及萌發(fā)等方面的研究。

1 種子發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)組研究

高等植物種子的發(fā)育可以分為3個(gè)時(shí)期：胚胎發(fā)生期、種子形成期和成熟休止期；主要經(jīng)歷組織分化、儲(chǔ)藏物質(zhì)積累和成熟干燥3個(gè)階段。在組織分化階段，受精卵細(xì)胞經(jīng)過快速的細(xì)胞分裂，發(fā)育成不同的種子組織；隨后，小細(xì)胞分裂、細(xì)胞膨脹、種子儲(chǔ)備物沉積（通常為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或碳水化合物）；最后，成熟干燥時(shí)種子發(fā)育減緩，干物質(zhì)停止積累，使種子處于新陳代謝靜止的階段［5］。種子發(fā)育的不同時(shí)期，不同組織的蛋白質(zhì)表達(dá)既存在差異性，也具有一定的相似性，其中一些蛋白質(zhì)在整個(gè)發(fā)育過程中都發(fā)揮著作用，并在某一時(shí)期大量積累來影響種子的形成與發(fā)育［6］。

1.1 組織分化階段的關(guān)鍵蛋白

種子從受精開始到胚形態(tài)初步建成的過程中不僅進(jìn)行著貯藏物質(zhì)的合成與分解，還伴隨著強(qiáng)烈的細(xì)胞分裂分化過程和有關(guān)細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁形成蛋白活動(dòng)的增加。有研究發(fā)現(xiàn)，大豆（Glycine max）種子發(fā)育過程中有2種蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞增大過程［7］。其中的一種蛋白 Skp 1（S－phase kinase－associated－protein 1）在種子發(fā)育15d時(shí)出現(xiàn)，隨著發(fā)育的進(jìn)行含量逐漸增加。Skp 1影響細(xì)胞分裂以及細(xì)胞擴(kuò)大與伸長，它的表達(dá)模式與其在胚胎發(fā)生和幼苗發(fā)育過程所起的作用相一致［8］；另一種蛋白是肌動(dòng)蛋白，它是細(xì)胞骨架的基本組成成分，參與胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞伸長、頂點(diǎn)生長以及細(xì)胞極性建成等過程［9］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）突變體中發(fā)現(xiàn)一種肌動(dòng)蛋白異構(gòu)體可能對(duì)細(xì)胞伸長有一定的作用，因?yàn)檫@種蛋白的表達(dá)和下胚軸伸長過程密切相關(guān)［10］，而在擬南芥種子萌發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)了肌動(dòng)蛋白7（ACT 7），從而進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論［11］。狹葉南洋杉種子胚胎形成的整個(gè)過程中幾丁質(zhì)酶（幾丁質(zhì)酶Ⅳ除外）活性一直很高，阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）在胚胎形成的前期顯著表達(dá)，主要促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化，而在種子后熟期表達(dá)量下降［12］。

1.2 與胚和胚乳發(fā)育相關(guān)的蛋白

種子發(fā)育期間，特異基因表達(dá)的特異蛋白與組織的形態(tài)建成、細(xì)胞的不同功能或機(jī)體的生理生化變化密切相關(guān)，因此研究該過程的特異蛋白質(zhì)對(duì)認(rèn)識(shí)胚分化發(fā)育的分子本質(zhì)有重要意義。在馬尾松（Pinus massoniana L.）種胚早期發(fā)育過程，調(diào)控碳代謝的蛋白在卵裂期和柱狀胚胎期顯著上調(diào)表達(dá)，為胚的發(fā)育提供糖類和能量；eIF 5A蛋白參與細(xì)胞程序性死亡和mRNAs的選擇性表達(dá)，對(duì)次生胚的消亡和胚柄的退化起著關(guān)鍵性作用；還有一些蛋白在調(diào)控蛋白質(zhì)的折疊、氮代謝和防御反應(yīng)過程發(fā)揮作用［13］。杉木（Cunninghamia lanceolata Lamb.Hook）早期胚發(fā)育過程有136個(gè)蛋白質(zhì)出現(xiàn)不同的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，其中有71個(gè)蛋白質(zhì)參與細(xì)胞程序性死亡和染色質(zhì)修飾，推測它們可能在決定合子數(shù)量、調(diào)控胚胎模式和形狀重構(gòu)方面發(fā)揮作用；而另外一些蛋白則與碳代謝、蛋氨酸代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)合成以及胚發(fā)育等生理活動(dòng)密切相關(guān)［14］。在水稻（Oryza sativa L.）種胚的生長、分化、成熟、脫水及休眠五個(gè)階段，共找到275個(gè)差異蛋白，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，胚發(fā)育早期高豐度蛋白主要參與代謝、蛋白合成與降解及其他細(xì)胞學(xué)功能，而發(fā)育晚期的高表達(dá)量蛋白主要與胚的脫水及休眠有關(guān)［15］。巴西松（Araucaria angustifolia （Bert）O.Ktze）合子胚發(fā)育早期高度積累的蛋白質(zhì)（如α－木糖苷酶）主要調(diào)控氧化應(yīng)激活動(dòng)，而胚發(fā)育后期貯藏蛋白（如豌豆球樣蛋白）以及與呼吸作用相關(guān)的蛋白（如磷酸丙糖異構(gòu)酶、果糖二磷酸異構(gòu)酶和異檸檬酸脫氫酶）逐漸積累［16］。狹葉南洋杉（Araucaria angustifolia）種子發(fā)育過程中，魚雷胚期共檢測到約230個(gè)蛋白，成熟胚期約340個(gè)蛋白，這是因?yàn)榉N子發(fā)育直至成熟過程貯藏蛋白和親水性的胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA）在不斷生成，從而保護(hù)組織細(xì)胞在脫水過程免受傷害［17］。

胚乳是由受精極核反復(fù)分裂而發(fā)育的營養(yǎng)組織，其發(fā)育過程涉及的蛋白質(zhì)不僅參與細(xì)胞的代謝與貯藏物質(zhì)的合成，而且還能作為貯藏物質(zhì)為發(fā)育或萌發(fā)中的胚提供養(yǎng)分［18］。在玉米（Zea mays L.）中鑒定了632個(gè)蛋白，初步建立了玉米胚乳蛋白質(zhì)表達(dá)譜：玉米胚乳發(fā)育早期，參與細(xì)胞分裂分化、細(xì)胞骨架和細(xì)胞壁沉積等結(jié)構(gòu)建成，呼吸代謝和抗活性氧的蛋白量最高；胚乳淀粉開始積累時(shí)，與分解糖類相關(guān)的酶豐度顯著提高；在胚乳積累貯藏物質(zhì)晚期，正磷酸丙酮酸二激酶在維持淀粉和蛋白質(zhì)平衡中發(fā)揮重要作用［19－20］。在小麥（Triticum aestivumL.）胚乳發(fā)育蛋白質(zhì)變化的研究中，鑒定了250多個(gè)蛋白質(zhì)，共涉及ATP轉(zhuǎn)換、碳水化合物代謝、細(xì)胞分裂等13個(gè)生化過程。在發(fā)育早期（開花后10d）胚乳中蛋白質(zhì)主要參與碳水化合物代謝、轉(zhuǎn)錄或翻譯、蛋白質(zhì)合成或組裝，之后是氮代謝、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)代謝，在發(fā)育后期（開花后36d）蛋白質(zhì)主要的功能為防御和貯藏［21］。Xu等［11］發(fā)現(xiàn)，在水稻胚乳細(xì)胞淀粉粒包裝完成時(shí)伴隨著活性氧的產(chǎn)生，之后胚乳細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡（PCD）過程，其中近70%的差異表達(dá)蛋白質(zhì)是氧化還原反應(yīng)的靶蛋白，它們參與淀粉合成、糖異生以及其他大分子分解代謝過程。由此推測氧化還原穩(wěn)態(tài)可能是協(xié)調(diào)淀粉合成、PCD以及PCD過程中細(xì)胞碳骨架流向淀粉合成的重要因子之一。Liu等［23］對(duì)麻瘋樹（Jatropha curcas）種子在發(fā)育過程中脂質(zhì)積累的六個(gè)階段進(jìn)行了分析，共鑒定出104個(gè)差異蛋白，這些蛋白共分屬10個(gè)功能類別。其中與能源和新陳代謝有關(guān)的蛋白積累的最多，并且這些蛋白參與碳通量脂肪的積累［22］。

1.3 成熟干燥階段的關(guān)鍵蛋白

成熟干燥是大多數(shù)種子完成發(fā)育的最后一步，大部分種子經(jīng)歷脫水干燥后才具有發(fā)芽能力。在植物種子胚胎發(fā)育后期，LEA是一類龐大而高度多樣化的蛋白，主要在植物的抗旱性和抗寒性方面發(fā)揮作用［23］。根據(jù)氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列，LEA蛋白可分為6組：LEA－Ⅰ蛋白為水分結(jié)合蛋白，防止細(xì)胞在干旱脅迫時(shí)水分流失，同時(shí)也在高等植物的胚胎發(fā)育和滲透壓防護(hù)方面起作用；LEA－Ⅱ蛋白在代謝中起分子伴侶和親水性溶質(zhì)的作用，在水分脅迫時(shí)可以防止蛋白聚集，穩(wěn)定和保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能；LEA－Ⅲ蛋白可以避免干旱脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)高濃度離子的累積所引起的損傷，也可以保護(hù)細(xì)胞中的酶免受干燥帶來的傷害，同時(shí)也可防止組織過度脫水，提高對(duì)鹽的耐受性；LEA－Ⅳ蛋白起束縛離子的作用，在種子干燥脫水時(shí)，保持膜的穩(wěn)定性；LEA－Ⅴ蛋白推測可能與種子成熟耐脫水性有關(guān)；LEA－Ⅵ蛋白研究較少，其中CaLEA 6蛋白在高鹽和脫水引起的水分虧損中起保護(hù)作用［24－25］。脫水素（DHNs）是一類具有親水性，耐熱性的應(yīng)激蛋白，并帶有大量電荷的氨基酸，屬于LEA－Ⅱ蛋白家族，其功能為保護(hù)細(xì)胞免受來自于干燥脅迫的脫水損傷［26］。它在成熟種子中含量很高，但是隨著種子萌發(fā)逐漸減少［27］。小熱休克蛋白（sHSPs）在種子成熟的胚胎中被發(fā)現(xiàn)，sHSPs與LEA蛋白的伴侶蛋白類似，可參與分子修飾和適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊，從而通過維護(hù)適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)完整性來保護(hù)細(xì)胞膜和相關(guān)蛋白以防種子脫水［28］。在水稻種子中鑒定出LEA，sHSPs，它們在初期積累，在干燥階段處于較高的水平，表明這些蛋白起到了抗旱的作用［29］。

2 種子休眠相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究

種子休眠性狀的表達(dá)能夠體現(xiàn)一系列基因表達(dá)的情況，與許多復(fù)雜的生理生化反應(yīng)和信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程密切相關(guān)，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以檢測種子休眠過程中蛋白質(zhì)積累的同步變化以及時(shí)間模式。Lee等對(duì)新鮮采集的臺(tái)灣山櫻桃（Prunus campanulatal Maxim）種子進(jìn)行高低交替變溫層積處理，利用2－DE技術(shù)發(fā)現(xiàn)種子休眠解除前后有71種蛋白豐度發(fā)生明顯變化，經(jīng)MS鑒定和序列比對(duì)得到DHNs、櫻桃甙Ⅰ前體、櫻桃甙Ⅱ前體以及櫻桃甙Ⅱ［30］。這是首篇有關(guān)木本植物打破休眠的蛋白質(zhì)組學(xué)分析報(bào)道。蘭海等［32］對(duì)強(qiáng)休眠玉米自交系08－641分別進(jìn)行休眠和破除休眠的種子的蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)分析，結(jié)果檢測出的差異蛋白主要有球蛋白、LEA、豆球蛋白等貯藏物蛋白質(zhì)，蛋白酶體、山梨醇脫氫酶等參與物質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)，熱激蛋白（HPS）等參與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞功能調(diào)控的蛋白質(zhì)。推測這些蛋白的過量表達(dá)或缺失抑制了種子的正常萌發(fā)［31］。種子處于休眠狀態(tài)時(shí)，LEA表達(dá)量通常很高。HPS作為分子伴侶參加多種細(xì)胞生理活動(dòng)，它的表達(dá)不僅受高溫?zé)峒ふT導(dǎo)還受發(fā)育調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)HPS在干燥成熟的種子中含量很高，但是隨著種子的萌發(fā)含量逐漸下降直至消失。這表明HPS是種子保持休眠所必須的蛋白。從種子休眠的本質(zhì)來看，它是植物在長期發(fā)育進(jìn)程中獲得的一種適應(yīng)環(huán)境變化以保持生存與進(jìn)化的生物學(xué)特性。由此可以推斷，種子對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)程度與休眠水平是一致的。

目前解釋種子休眠的主要假說之一是植物激素的調(diào)控作用。ABA是通過合成和代謝過程中不同酶基因的表達(dá)來影響ABA的水平，而GAs在種子休眠解除中的作用一直備受爭議，雖然GAs的積累與解除休眠有關(guān)，但GAs的單獨(dú)作用并不刺激所有物種［32］。近幾年通過調(diào)控ABA／GAs的閾值范圍解除種子休眠，ABA和GA相互抑制對(duì)方的合成與分解代謝基因，兩者均可調(diào)控а－淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來發(fā)現(xiàn)，AUX參與調(diào)控種子的休眠，其要調(diào)控胚根突出，AUX信號(hào)與ABA信號(hào)存在交叉，AUX通過其響應(yīng)蛋白ARF 10／16間接調(diào)控ABA信號(hào)通路中 ABI 3的穩(wěn)定性來調(diào)控?cái)M南芥種子休眠［33］。在擬南芥種子中發(fā)現(xiàn)，外施ABA后能夠觸發(fā)種子內(nèi)部蛋白水解。甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）、1，6－果糖二磷酸醛縮酶、延伸因子EF－1和2，α－微管蛋白、分子量約70kD的熱休克蛋白（HSP 70）、脫水素、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶以及核糖體蛋白與擬南芥種子休眠解除密切相關(guān)［34］。利用35S－甲硫氨酸標(biāo)記表明，外源ABA不會(huì)抑制蛋白質(zhì)的重新合成。此外，吸脹的休眠種子中有新合成的蛋白質(zhì)，說明抑制種子萌發(fā)的原因不是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)翻譯的停滯［35］。用水、ABA和GAs分別對(duì)歐洲山毛櫸（Fagus sylvatica L.）眠休種子進(jìn)行處理，用水處理的種子破眠蛋白多參與能量代謝和蛋白質(zhì)定位，在ABA處理下的種子破眠蛋白大多與能量代謝、蛋白質(zhì)定位以及種子發(fā)育有關(guān)，而經(jīng)GAs處理的種子相應(yīng)破眠蛋白多與能量代謝、植物防御有關(guān)，由此推測種子休眠狀態(tài)的解除涉及多種蛋白質(zhì)的參與，從最初的信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝、貯藏物質(zhì)動(dòng)員到最后的細(xì)胞再生都與種子休眠密切相關(guān)［36］。在研究ABA和GAs兩種激素對(duì)挪威槭（Acer platanoides L.）種子休眠解除和萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)ABA調(diào)控大多數(shù)蛋白下調(diào)表達(dá)，而GAs調(diào)控蛋白上調(diào)表達(dá)，并且多數(shù)蛋白質(zhì)變化都發(fā)生在種子層積后期，此時(shí)正是種子從靜止?fàn)顟B(tài)向萌發(fā)轉(zhuǎn)變的活躍時(shí)期。其中S－腺苷甲硫氨酸合成酶、富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白、ABI 3－互作蛋白Ⅰ，EF－2和腺苷高半胱氨酸酶對(duì)打破休眠起著關(guān)鍵作用［37］。

3 種子萌發(fā)相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究

種子萌發(fā)是胚從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)樯砘钴S狀態(tài)，并長成自養(yǎng)幼苗的一系列過程。萌發(fā)以種子吸水為開始，胚根的出現(xiàn)為結(jié)束。種子萌發(fā)分為3個(gè)階段：第Ⅰ個(gè)階段種子吸水膨脹，鮮重迅速增加，成熟種子中的蛋白質(zhì)被激活；第Ⅱ階段為代謝發(fā)生階段，種子鮮重幾乎不增加，依靠成熟種子中儲(chǔ)存的mRNA合成蛋白質(zhì)，建立代謝體系；第Ⅲ階段幼苗形態(tài)建成，胚根突破種皮，標(biāo)志著種子萌發(fā)結(jié)束，這一階段生長迅速，鮮重增加［38］。在通常情況下，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要生物過程為第Ⅰ和第Ⅱ階段［39］。

3.1 種子吸脹相關(guān)的蛋白質(zhì)

近年來，涉及種子吸脹過程的一些蛋白質(zhì)已經(jīng)得到鑒定，例如α和β－微管蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）、順烏頭酸酶、過氧化氫酶、WD－40重復(fù)蛋白以及ACT蛋白等。種子萌動(dòng)后，內(nèi)部貯藏物質(zhì)需要經(jīng)過分解，才可以轉(zhuǎn)移到胚中來支持其迅速生長，并需要迅速合成相應(yīng)的酶類。在大麥萌發(fā)的種子中發(fā)現(xiàn)大量的α－淀粉酶（AMY）的同工型蛋白質(zhì)，在胚乳貯藏淀粉的快速降解中至少存在1種AMY 1蛋白和2種AMY 2蛋白［40］。硫氧還蛋白（Trx）是一種重要的酶活力調(diào)節(jié)蛋白，能提高淀粉酶活性和蛋白酶活性，增加貯藏蛋白的水溶性，使種子中貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)更容易水解，啟動(dòng)碳氮代謝。在大麥種子萌發(fā)的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著Trx活性的上升，淀粉酶活性、貯藏蛋白的相對(duì)還原狀態(tài)有所上升［41］。在狹葉南洋杉種子萌發(fā)期間也發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白高度表達(dá)，該蛋白與細(xì)胞自由基清除有關(guān)［42］。擬南芥中股氧化物的酶類豐度變化顯著，酶活性方便檢測，且與種子萌發(fā)密切相關(guān)。抗壞血酸（AsA）是植物中一種重要的氧化還原緩沖物，可以有效的保持細(xì)胞的還原狀態(tài)，而單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）與AsA的再生有關(guān)；MDAR蛋白在大麥吸水膨脹階段豐度變化顯著，可以推測該蛋白參與種子萌發(fā)初期階段的代謝調(diào)節(jié)［43－44］。

3.2 種子代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)

這一階段氨基酸代謝、儲(chǔ)藏物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)翻譯、能源代謝等幾類蛋白的豐度發(fā)生變化，而且至少要三類蛋白共同作才能完成種子向幼苗狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。其中，甲硫氨酸合酶、半胱氨酸合酶、SAM－合酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為氨基酸代謝類的蛋白，前兩種蛋白與紫花苜蓿種子萌發(fā)有關(guān)，后兩種與擬南芥萌發(fā)相關(guān)［45－46］。儲(chǔ)藏物質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白也發(fā)揮重要作用，如蛋白酶和淀粉酶等在這一階段活性較高［47］。參與吸脹的蛋白HSPs、LEA在這一階段也發(fā)揮作用。延伸因子、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）、核糖體蛋白等與翻譯相關(guān)的蛋白，在這一階段發(fā)揮重要作用［48］。其中，延伸因子與翻譯后的mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，也與細(xì)胞分裂過程關(guān)系密切［49］，PDI與新生肽鏈二硫鍵合成和異構(gòu)相關(guān)［50］。與能量代謝相關(guān)的蛋白主要集中在代謝階段，如UDP－葡萄糖焦磷酸化酶、磷酸果糖激酶、3－磷酸甘油醛脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等，與糖酵解途徑密切相關(guān)［51］。

3.3 種子生根相關(guān)的蛋白質(zhì)

有研究發(fā)現(xiàn)，芥子酶、SAM－合成酶、LEA、HSP、種子成熟蛋白－SMP和延伸因子EF－Tu都參與了胚根的 伸 長 過 程［52］。Vivek 等 發(fā) 現(xiàn)，在 桃 兒 七（Podophyllum hexandrumRoyle）種子萌發(fā)期間細(xì)胞壁水解酶如β－1，3－葡聚糖酶、XET、CDC 2激酶以及SDH等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胚根伸出［53］，從而在蛋白質(zhì)組的水平上驗(yàn)證了Sreenivasulu等［54］認(rèn)為的桃兒七種子萌發(fā)困難是由于胚乳細(xì)胞壁較厚導(dǎo)致的這一猜想。

3.4 種子萌發(fā)期間代謝途徑的研究

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究種子萌發(fā)期間相關(guān)蛋白質(zhì)組的變化，能夠系統(tǒng)地掌握更多復(fù)雜生理過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）作為核心代謝途徑，為種子萌發(fā)過程提供大量能量，其相關(guān)的蛋白質(zhì)也在許多物種的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得以鑒定，從而建立種子萌發(fā)時(shí)期的代謝蛋白圖譜。

種子吸脹后，氨基酸和相關(guān)的有機(jī)酸的含量連續(xù)地增加，并且磷酸化的糖，包括果糖－6－磷酸和葡萄糖－6－磷酸，含量急速增加，這表明分解代謝被激活。其中磷酸化糖需要轉(zhuǎn)化成蔗糖，才能進(jìn)到糖酵解途徑來提供能量。在水稻種子萌發(fā)不同時(shí)期蛋白質(zhì)變化的研究中，有148個(gè)蛋白表達(dá)差異，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白主要是參與EMP的酶途徑，包括UDP－葡萄糖脫氫酶、果糖激酶、葡萄糖磷酸變位酶和丙酮酸脫羧酶［55］。UDP－葡萄糖焦磷酸化酶、3－磷酸甘油醛脫氫為EMP途徑中關(guān)鍵蛋白，與種子活力呈正相關(guān)［56］。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、異檸檬酸脫氫酶為TCA循環(huán)中關(guān)鍵蛋白，能夠調(diào)節(jié)TCA途徑的活性，其中，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體可以催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰－CoA，完成EMP和TCA途徑的連接，而該蛋白的減少會(huì)限制種子內(nèi)氧氣的消耗，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，從而影響種子萌發(fā)［5］。

戊糖磷酸途徑（PPP）是葡萄糖另一條有氧代謝途徑，有研究表明PPP與種子萌發(fā)相關(guān)，調(diào)節(jié)PPP途徑與EMP途徑之間的平衡，有助于種子萌發(fā)。測定葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（G－6－PDH）和6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6－PGDH）是PPP途徑的關(guān)鍵酶，在種子萌發(fā)研究中，多數(shù)是通過生理方法測定酶活，因此用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法中鑒定該途徑差異蛋白的報(bào)道并不多。乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶為蘋果酸脫氫酶，Ghosh在綠豆子葉中鑒定出該酶，以確定種子萌發(fā)中乙醛酸循環(huán)的存在，脂肪酸經(jīng)過此循環(huán)產(chǎn)生琥珀酸［57］。

4 展 望

蛋白質(zhì)組學(xué)原理的提出和技術(shù)的建立，解決了在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模的直接研究基因功能的問題，為研究種子發(fā)育、休眠和萌發(fā)的分子機(jī)理提供了有效的手段?，F(xiàn)階段一些通過基因組測序而新發(fā)現(xiàn)基因編碼的蛋白質(zhì)功能都無從查詢，而對(duì)那些已知功能的蛋白質(zhì)而言，可以通過同源基因功能類推等方法來確定期功能。因此，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的相互結(jié)合，能深入地研究種子發(fā)育萌發(fā)過程中mRNA與蛋白質(zhì)的相關(guān)性、蛋白質(zhì)之間的相互作用以及其代謝通路。這為揭示種子休眠與萌發(fā)機(jī)制提供強(qiáng)有力保障，為種子基因組的研究提供有力依據(jù)，從而為更多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)問題的解決提供理論指導(dǎo)。

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