鹽旱交叉脅迫對(duì)大豆萌發(fā)期保護(hù)酶的影響

， ， ， (山西大同大學(xué) .生命科學(xué)學(xué)院; .綜合分析與測試中心， 山西 大同 037009)

鹽旱交叉脅迫對(duì)大豆萌發(fā)期保護(hù)酶的影響

張永芳a，王潤梅a，趙麗華b，劉麗萍a
(山西大同大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院; b.綜合分析與測試中心， 山西 大同 037009)

為了研究鹽旱交叉脅迫對(duì)大豆萌發(fā)期保護(hù)酶活性的影響，以中黃25號(hào)大豆為試驗(yàn)材料，采用水培法培養(yǎng)并對(duì)其進(jìn)行鹽旱交叉脅迫處理，測定脅迫下過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性變化。結(jié)果表明：鹽旱交叉脅迫下，隨著脅迫程度的加劇，CAT活性整體呈下降趨勢，其中180 mmol/L NaCl和25%～30% PEG-6000交叉脅迫處理時(shí)，CAT活性明顯高于其它處理組；在同一鹽分濃度和不同濃度PEG-6000交叉脅迫下， PEG-6000濃度梯度為20%，25%和30%時(shí)，隨著PEG-6000濃度的增加，POD活性基本都呈下降趨勢；但在同一PEG-6000濃度和不同鹽濃度的交叉脅迫下，隨著NaCl濃度的增加，POD活性卻逐漸升高。以上結(jié)果表明,在150 mmol/L NaCl鹽、20% PEG-6000旱脅迫下，大豆可通過調(diào)節(jié)其保護(hù)酶活性以適應(yīng)逆境，增強(qiáng)抗鹽、抗旱能力。

大豆； 鹽旱交叉脅迫； 保護(hù)酶

大豆是優(yōu)質(zhì)蛋白和食用油脂的重要來源，在我國長江流域，黃河流域，江南以及東北三省，西南等地區(qū)多有種植，然而近幾年來，其產(chǎn)量卻呈下降趨勢，原因是隨著環(huán)境條件的變化，植物往往同時(shí)或相繼經(jīng)受多種環(huán)境脅迫[1]，特別是鹽脅迫和干旱脅迫，導(dǎo)致不能滿足大豆各生育期需水量，使得根系欠發(fā)達(dá)，吸水困難[2]。因此，如何有效利用這些鹽旱土壤，提高大豆產(chǎn)量成為目前農(nóng)業(yè)研究的主要課題之一。

聚乙二醇(PEG)作為一種高分子滲透劑，親水性較強(qiáng)[3]，不能穿越植物細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而引起質(zhì)壁分離，因此可人工模擬干旱脅迫；氯化鈉作為高濃度物質(zhì)也可使細(xì)胞滲透失水而發(fā)生質(zhì)壁分離、膜透性增加，膜內(nèi)大量離子外滲[4-8]，膜外大量Na+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)膜，細(xì)胞內(nèi)膜兩邊離子失去平衡。

目前，關(guān)于鹽或干旱單一耐性對(duì)大豆影響的研究較多。陳慶華研究了干旱脅迫對(duì)大豆苗期葉片保護(hù)酶活性等的影響，結(jié)果表明：隨著干旱脅迫的加強(qiáng)，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等的活性表現(xiàn)為先升后降的趨勢，輕度脅迫下質(zhì)膜透性和丙二醛含量增幅較小，重度脅迫時(shí)增幅明顯增大[9]。李建英等研究指出，干旱脅迫后化控種衣劑能提高大豆幼苗葉片POD和SOD的活性，提高抗旱性[10]；高亞梅等研究了不同大豆品種在干旱脅迫下各相關(guān)酶系的變化，結(jié)果表明：干旱脅迫下大豆根中SOD，POD，CAT活性增加顯著，從而得出SOD、POD、CAT都是大豆保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分的結(jié)論[11]；許東河等研究了鹽脅迫對(duì)大豆生理指標(biāo)的影響，表明膜脂質(zhì)過氧化是大豆鹽傷害的重要原因[12]。但是針對(duì)鹽和干旱交叉脅迫對(duì)大豆影響的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究擬以中黃25號(hào)大豆為實(shí)驗(yàn)材料，研究其萌發(fā)期在鹽旱交叉脅迫下生理指標(biāo)變化，探尋最有利于大豆生長的鹽濃度和PEG濃度，為更好地利用鹽堿土，提高大豆產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材 料

試驗(yàn)材料為中黃25號(hào)大豆種子。

1.1.2 儀 器

恒溫培養(yǎng)箱、SP-754型紫外分光光度計(jì)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、ST 16 R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)、BS 223 S型精密電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 種子處理及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用籽粒大小均勻、飽滿的中黃25號(hào)大豆種子，用清水將其沖洗干凈，然后經(jīng)0.1% HgCl2溶液消毒8～9 min后，用蒸餾水沖洗3～4次，最后用溫水(25 ℃)將其避光浸泡72 h左右進(jìn)行催芽，待其胚芽長到1.5 cm左右時(shí)，全部放置到鋪有3層濾紙、噴以Hoagland營養(yǎng)液(以剛浸濕濾紙為宜)的干凈培養(yǎng)皿中，各培養(yǎng)皿放置6粒大豆種子，以進(jìn)行相應(yīng)的脅迫處理。本次試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括1個(gè)對(duì)照， 9個(gè)鹽旱交叉脅迫處理，其中，3個(gè)鹽分脅迫處理梯度為S 1(120 mmol/L)，S 2(150 mmol/L)和S 3(180 mmol/L)NaCl溶液，每個(gè)處理3次重復(fù)。以PEG-6000人工模擬干旱脅迫。3個(gè)干旱脅迫梯度為輕度脅迫T 1(PEG-6000濃度為20%)，中度脅迫T 2(PEG-6000濃度為25%)，重度脅迫T 3(PEG-6000濃度為30%)。

1.3 試驗(yàn)方法及處理

鹽旱脅迫各處理中，每個(gè)培養(yǎng)皿每次加3 mL NaCl溶液和3 mL PEG-6000溶液。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 測定指標(biāo)

脅迫處理10 d后選取發(fā)芽勢好的大豆種子，先用蒸餾水沖洗一下，以清除豆子表面殘留的NaCl溶液和PEG-6000溶液，然后稱取0.5～1.0 g測定其保護(hù)酶活性，每個(gè)處理隨機(jī)取樣。采用紫外吸收法測定CAT的活性，用愈創(chuàng)木酚法測定POD的活性。每個(gè)處理以1 min內(nèi)A240降低0.1為1個(gè)CAT酶活性單位；以470 nm波長下，每分鐘OD增加0.01定義為1個(gè)POD酶活性單位。

1.4.2 測定方法

CAT活性測定：測定方法參照文獻(xiàn)[13]。

POD活性測定：將稱取好的大豆種子1.0 g剪碎置于已在冰中預(yù)冷的研缽中，加少量石英砂和少量磷酸緩沖液(pH=7.0)，冰浴研磨勻漿后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，搖勻。取5 mL于離心管，同樣在4 ℃、15 200 r/min下冷凍離心20 min，上清液即為POD酶液。取10 mL具塞試管3支(3次重復(fù))，各加入酶液1 mL，0.1%愈創(chuàng)木酚1.0 mL，磷酸緩沖液(pH=7.0)1.0 mL，搖勻，加入0.18% H2O21.0 mL后，于25 ℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，最后分別加5%偏磷酸0.2 mL終止反應(yīng)。用蒸餾水調(diào)零，于分光光度計(jì)上測定3支試管的A470，每30 s讀數(shù)1次，共測6次。

1.4.3 CAT和POD酶活性計(jì)算公式

CAT活性[U/(g·min)]=ΔA240×Vt/0.1×Vs×t×FW

式中，ΔA240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值(降低)；Vt為酶提取液總體積(5 mL)；Vs為測定時(shí)取酶液的體積(0.1 mL)；t為測定時(shí)的總時(shí)間(3 min)；FW為樣品鮮重(0.5 g)。

POD活性[U/(g·min)]=ΔA470×Vt/FW×Vs×t

式中，ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值(升高)；Vt為酶提取液總體積(5 mL)；Vs為測定時(shí)取酶液的體積(1.0 mL)；t為測定時(shí)的總時(shí)間(3 min)；FW為樣品鮮重(1.0 g)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽旱交叉脅迫下中黃25號(hào)發(fā)芽種子中CAT活性變化

由圖1可知，在不同鹽濃度處理下，隨著鹽濃度的增加，CAT活性整體基本上呈下降趨勢。在同一NaCl濃度和不同PEG-6000濃度脅迫下，隨著干旱脅迫程度的增加，CAT活性也基本呈下降趨勢，但在180 mmol/L NaCl和25% PEG-6000交叉脅迫下，CAT活性卻明顯高于另外2個(gè)處理組，這說明較高鹽分與干旱交叉脅迫能刺激CAT活性升高，迅速清除過多的自由基，從而防止對(duì)膜上以及膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化作用。

圖2表明，在不同濃度PEG處理下，在輕度干旱(20% PEG-6000)脅迫下，隨著鹽分脅迫濃度的增加，CAT活性呈先上升后下降的趨勢。在中度干旱脅迫下，隨著鹽分濃度的增加CAT活性大致呈上升趨勢，同時(shí)可以明顯看出，中等濃度150 mmol/L NaCl 脅迫下相對(duì)于120 mmol/L NaCl脅迫下的CAT活性略有下降，不顯著(p=0.843gt;0.05)，但在180 mmol/L NaCl脅迫下CAT 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前兩者，CAT活性在此時(shí)達(dá)到最大值?？赡苁撬谳^高鹽分和干旱的交叉脅迫下活性大增，清除自由基的能力增強(qiáng)，從而避免因自由基積累引發(fā)的膜脂過氧化作用對(duì)細(xì)胞造成的傷害，因而對(duì)高強(qiáng)度的逆境有一定的適應(yīng)能力。在重度干旱和不同鹽分交叉脅迫下，CAT活性相對(duì)于輕度和中度干旱脅迫下的都低，這可能是由于脅迫程度加劇，其抗氧化能力降低，自由基大量積累，膜脂發(fā)生過氧化作用，細(xì)胞膜遭到破壞，但在這同一重度干旱脅迫水平下，180 mmol/L NaCl脅迫時(shí)，CAT活性比前兩者都高。其中，高鹽脅迫與中等鹽脅迫下CAT活性達(dá)到顯著差異(p=0.019lt;0.05)。這說明在細(xì)胞已遭受嚴(yán)重傷害的情況下，CAT還能繼續(xù)維持一定時(shí)間的穩(wěn)定性，甚至通過升高活性來盡可能降低自由基對(duì)細(xì)胞的傷害。這同樣再次說明了中黃25號(hào)大豆耐鹽力高的品質(zhì)優(yōu)勢是使其高產(chǎn)的原因之一。

圖1 鹽旱交叉脅迫下CAT活性變化

圖2 鹽旱交叉脅迫下CAT活性變化

通過單因素方差分析，在不同的交叉脅迫下進(jìn)行多重比較，各個(gè)處理組之間CAT活性變化不顯著(p=0.348gt;0.05)，說明不同鹽旱交叉脅迫對(duì)CAT的活性影響不是很大，可能CAT不是中黃25號(hào)大豆起主要作用的保護(hù)酶。

2.2 鹽旱交叉脅迫下中黃25號(hào)發(fā)芽種子中POD活性變化

由圖3可知，在同一NaCl濃度和不同濃度的PEG-6000交叉脅迫下，隨著PEG-6000溶液濃度的增加，POD活性基本都呈下降趨勢。但在120 mmol/L NaCl和不同濃度的PEG-6000交叉脅迫下，POD活性先升高后降低，但在輕度干旱(20% PEG-6000)和中度干旱(25% PEG-6000)脅迫下的活性變化達(dá)極顯著(p=0.001lt;0.01)，這可能是由于中黃25號(hào)大豆具有一定的抗旱性，它能迅速提高POD的活性來清除氧自由基，免除了細(xì)胞發(fā)生過氧化，因此，此時(shí)的逆境對(duì)種子影響不大，種子受水分脅迫較小，產(chǎn)生的氧自由基等不多。

由圖4可知，在同一濃度的PEG-6000和不同濃度的NaCl交叉脅迫下，隨著脅迫程度的加劇，POD活性整體在逐漸下降。而在各同一干旱脅迫水平，即PEG-6000濃度梯度為20%，25%和30%下，隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD活性基本呈上升趨勢。在輕度干旱(20% PEG-6000)脅迫處理水平，隨著鹽分脅迫處理濃度的增加，150 mmol/L和180 mmol/L NaCl脅迫下POD活性都升高，在濃度為180 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)到最大值；在中度干旱脅迫處理水平POD活性變化和上述情況一樣， 這表明中黃25號(hào)大豆在一定的較高鹽和干旱交叉脅迫范圍內(nèi)，能通過迅速提高POD活性，清除自由基，免除了氧自由基對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的破壞作用，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和生命代謝的正常運(yùn)行，表現(xiàn)出一定的適應(yīng)能力；在重度干旱脅迫處理水平，POD活性相較于中度干旱脅迫下明顯降低，可能雙重脅迫下，自由基大量產(chǎn)生并積累，胞質(zhì)膜發(fā)生過氧化作用而遭到破壞，同時(shí)也可從圖中得知，隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD活性基本也呈上升趨勢，在180 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)到最大值。上述結(jié)果表明，中黃25號(hào)大豆具有一定的抗鹽和抗旱能力，雖然隨著二者交叉脅迫程度的增加，POD活性整體下降，但在各個(gè)干旱脅迫濃度梯度下，POD活性隨著鹽濃度的增加活性都保持相對(duì)較高水平，尤其是在180 mmol/L NaCl脅迫下較150 mmol/L NaCl脅迫下保持較高水平，呈現(xiàn)一定的穩(wěn)定性，這可能與中黃25號(hào)為高產(chǎn)大豆品種有關(guān)。

用單因素方差分析，在不同的交叉脅迫下，通過多重比較，各個(gè)處理組整體之間POD活性變化不顯著(p=0.175gt;0.05)。但是，在低鹽與重度干旱交叉脅迫處理組下POD活性和高鹽與輕度干旱交叉脅迫處理組下POD活性有顯著差異(p=0.029lt;0.05)；在中等鹽脅迫處理水平下，輕度干旱和重度干旱脅迫下的POD活性達(dá)到顯著差異(p=0.027lt;0.05)；同樣，在高鹽脅迫處理水平下，輕度干旱和重度干旱脅迫下的POD活性也達(dá)到顯著差異(p=0.05)。此外，在中等鹽與重度干旱脅迫處理組下POD活性有顯著差異(p=0.013lt;0.05)。以上結(jié)果說明，POD是中黃25號(hào)大豆保護(hù)系統(tǒng)中主要的保護(hù)酶之一。

圖3 鹽旱交叉脅迫下POD活性變化

3 討論與結(jié)論

自由基傷害學(xué)說認(rèn)為，植物細(xì)胞中存在著能清除活性氧自由基的保護(hù)酶系，如CAT、POD等，它們的協(xié)調(diào)作用能有效清除羥自由基、H2O2等自由基，防御膜脂過氧化，使細(xì)胞免受其傷害[14]。根據(jù)這個(gè)學(xué)說，通過在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工模擬或?qū)嵉匮芯吭诂F(xiàn)實(shí)存在的各種逆境下，不同植物體內(nèi)的保護(hù)酶，如SOD、CAT、POD活性的變化，以此來作為植物抗逆性強(qiáng)弱的一種指標(biāo)，同時(shí)也可以作為鑒定特定品種特性的依據(jù)。

本研究以高產(chǎn)大豆品種中黃25號(hào)進(jìn)行了不同的鹽旱交叉脅迫處理，結(jié)果表明：中黃25號(hào)大豆具有較強(qiáng)的抗鹽與抗旱性，且抗鹽能力更高，它的CAT和POD活性在高鹽和各種水平的干旱交叉脅迫下仍能保持相對(duì)較高的活性和穩(wěn)定性，甚至有活性升高的表現(xiàn)。其中CAT活性和POD活性在20% PEG-6000和150 mmol/L NaCl交叉脅迫處理下都處于較高水平，同時(shí)最有益于大豆的生長。而保護(hù)酶起著關(guān)鍵作用，可清除自由基，防止自由基對(duì)膜上和膜內(nèi)的不飽和脂肪酸的氧化，保護(hù)膜的完整性使種子免受傷害。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)僅僅對(duì)發(fā)芽期大豆的2個(gè)保護(hù)酶的活性變化進(jìn)行了研究，其他大豆苗期在鹽旱交叉脅迫下保護(hù)酶活性變化有待進(jìn)一步探討。

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Effects of Salt and Drought Intercross Stresses on Activity of Protective Enzymes in Germination Stage of Soybean

ZHANGYongfanga，WANGRunmeia，ZHAOLihuab，LIULipinga

2016-06-30

山西大同大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(編號(hào)：2015 Q 15)。

張永芳(1982—)，女，山西朔州人；講師，碩士，研究方向：植物生理及分子生物學(xué)；E-mail:107987188@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.096

S 565.1

A

1001-4705(2016)11-0096-04