小麥氮素高效育種研究進展

徐 晴，許甫超，董 靜，秦丹丹，李梅芳

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，湖北武漢 430064)

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小麥氮素高效育種研究進展

徐 晴，許甫超，董 靜，秦丹丹，李梅芳

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，湖北武漢 430064)

摘要：氮素是植物生長的必需元素，也是糧食作物產(chǎn)量的一個重要限制因素。培育氮素高效利用的農(nóng)作物新品種不僅可以降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，還可以從根本上解決氮素施用不當造成的各種問題，是新一代綠色高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向。本文綜述了當前小麥氮素高效利用育種研究進展，包括小麥氮素利用效率的評價、小麥氮素響應的基因型差異、影響小麥氮素利用率的形態(tài)及理化性狀、小麥氮素利用相關基因的挖掘及分子育種與傳統(tǒng)育種相結合提高氮素利用率等。

關鍵詞：小麥；氮素利用效率；種質資源

氮素是植物生長的必需元素之一，它調控植株生長發(fā)育的多個進程。研究表明，作物葉片中75%的還原氮以Rubisco酶的形式參與植株的光合作用[1]。同時，它也是植物體內蛋白質、氨基酸、細胞膜分子復合物及激素、維他命等分子的組成成分，對植物體的生長發(fā)育起著至關重要的作用[2]。

在農(nóng)田中，作物所需氮素主要來自于有機肥料的分解和土壤對氮素的固定。自20世紀60年代第一次綠色革命倡導無機化肥對作物生長的促進作用以后，合成肥料尤其是氮肥被大量推廣應用，不僅促進了糧食的大幅增產(chǎn)，也解決了人們的溫飽問題[3]。由于顯著的增產(chǎn)作用，在過去的幾十年中，氮肥消耗量在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料投入中保持著持續(xù)增長的趨勢[4]。目前，我國已經(jīng)成為世界上氮肥生產(chǎn)和消費量最大的國家[5]。然而，過量施用氮肥造成各種問題正日益凸顯。首先，其對作物的增產(chǎn)作用正逐漸降低，1980至2005年間我國氮肥利用效率下降了近24%[4]。其次，我國氮肥施用已經(jīng)進入過剩狀態(tài)，利用率下降，造成資源浪費。數(shù)據(jù)顯示，至2000年，我國氮肥的施用量已經(jīng)超過200 kg·hm-2，遠高于印度(100 kg·hm-2)和發(fā)達國家(120 kg·hm-2)[6]。由于氮肥的當季利用率僅有30%～40%，多余的氮肥以淋溶、反硝化、揮發(fā)等方式流失，并增加環(huán)境污染的風險[7]。同時，氮肥施用量的不斷增加也直接導致了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的增高，給農(nóng)民和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟壓力。

小麥是我國僅次于水稻的第二大糧食作物，其耕種面積占全國糧食作物耕種面積的26%，僅2006年小麥的產(chǎn)量就達到了1.04億噸，占全國總糧食產(chǎn)量的20.7%和世界小麥產(chǎn)量的16%[8]。在以產(chǎn)量為第一性狀的育種模式下，我國目前主推小麥品種均需要中高以上肥水條件，氮肥利用水平低，氮素高效利用品種匱乏。雖然育種家都已經(jīng)意識到目前小麥育種中由于品種氮素利用效率不高及氮肥過量施用所造成的各種問題，但由于小麥氮素性狀控制復雜、氮素利用效率評價指標不一、氮素吸收利用機理研究不夠透徹等問題，極大地阻礙了小麥氮高效品種的選育[9]。因此，本文對小麥氮素吸收利用的基因型差異、高氮效小麥種質篩選與評價、與小麥氮素吸收利用相關的生理形態(tài)指標、小麥氮素利用相關基因位點的挖掘和克隆等方面的研究進展進行了綜述，以期為氮高效小麥品種的選育提供幫助。

1小麥氮素利用效率的基因型差異

作物氮素利用具有較大的基因型差異。研究發(fā)現(xiàn)，在低氮素供應條件下，作物產(chǎn)量的基因型差異主要是由氮素的吸收效率決定；而在高氮素供應條件下，作物產(chǎn)量則由氮素的吸收效率和利用效率共同決定[14]。根據(jù)不同基因型小麥在不同氮素水平的響應情況，可以將小麥劃分為不同類型。王永華等，依據(jù)氮素利用效率(NUE)將20個基因型小麥分為雙高效型(在低氮和高氮條件下均有較高的NUE)、低氮高效型(只在低氮條件下具有較高的NUE)、雙低效型(在高氮和低氮條件下均不能獲得較高的NUE)和高氮高效型(僅在高氮條件下具有較高的NUE)。但需要指出，不同基因型小麥氮素利用對不同肥力水平的氮素利用表現(xiàn)也不一致，不能單純地以作物在某一養(yǎng)分濃度時的生物產(chǎn)量或籽粒產(chǎn)量對氮素利用效率進行分類，而應該采取對氮素的響應度進行分類[15]。例如，有的基因型在低氮條件下能獲得較高的產(chǎn)量，但增施氮肥時，產(chǎn)量增加并不顯著，屬于低氮耐受型；而有的基因型雖然在低氮條件下產(chǎn)量受限，但一旦增施氮肥，產(chǎn)量能大幅提高，屬于氮素敏感型；有的基因型無論高氮或低氮條件均能反應迅速，并獲得較高的產(chǎn)量。這些不同的氮反應類型可能與作物本身不同的氮素吸收、代謝、轉運機制有關。在大麥、油菜等作物的相關研究中也得到相似的結果[16-17]。因此，利用氮素吸收的基因型差異篩選氮素利用效率高的種質，進而培育出氮素高效的品種已經(jīng)成為育種家的共識[11]。同時，要注意慎重選擇田間篩選條件，充分了解不同種質在不同環(huán)境中的特性，為育種提供幫助。

2小麥氮素高效利用種質的評價

除了通過施肥方式、土壤管理、灌溉等田間栽培措施提高氮素利用效率外，廣泛開展不同時期、不同地區(qū)的小麥種質資源的收集和評價工作，篩選氮素高效吸收、轉運和積累的種質材料，對新品種選育具有重要意義[10]。

如何對氮素利用效率進行定義是種質評價首先要解決的問題。一般來講,作物氮素利用效率(NUE:Nitrogen Use Efficiency)是指土壤中單位氮素(Ns:包括土壤中殘留氮素和新施入氮素)所能產(chǎn)生的籽粒產(chǎn)量(Gw)，即NUE=Gw/Ns。它可以被分為兩個部分即氮素吸收效率(NupE=Nt/Ns，反映植株從土壤中吸收氮素所能形成的地上部生物學產(chǎn)量的能力，Nt為地上部吸收的氮量)和氮素籽粒生產(chǎn)效率(NutE=Gw/Nt，反映植株吸收氮素轉化成籽粒產(chǎn)量的能力[12])。

另外，氮素收獲指數(shù)(NHI，nitrogen harvest index)、地上部氮素積累量(AGN，above-ground N uptake)、籽粒氮素濃度(GNC，grain nitrogen concentration)、根長密度(RLD，Root length density)、綠面積指數(shù)(GAI，Green area index)、葉片氮素含量(SLN，Specific leaf nitrogen content)、光飽和條件下CO2交換率(Amax，light-saturated CO2exchange rate)、氮素再分配效率(NRE:Nitrogen remobilization efficiency)等也常作為氮素利用效率的一些常用評價指標[13]。不同指標的具體計算公式見表1[13]。

3影響小麥氮素利用效率的形態(tài)及理化性狀

小麥對氮素的吸收利用是一個動態(tài)的變化過程，包括氮素的吸收、同化、利用、分配、再循環(huán)、再分配、再利用等。在不同生長階段，影響小麥氮素吸收利用的因素不同。

3.1小麥根系性狀對氮素利用效率的影響

開花前的營養(yǎng)生長階段是小麥氮素吸收和同化的主要階段。此時，負責氮素吸收的根系性狀是影響氮素吸收的關鍵因子。小麥根通常有六條種根和10～15條冠狀根系組成，根系最長可達140～200 cm(冬小麥)或80～120 cm(春小麥)[18]。由于小麥根系田間生長的復雜性、取樣困難等問題，根系性狀與氮素利用之間的相關性評價一直是一個棘手的問題[19]。目前根系相關研究中通常采用“Rhizoponics”或者水培系統(tǒng)進行[20-21]。汪曉麗等采用水培的方法研究不同濃度氮素對小麥根系的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度氮可以促進根系生長，但是高濃度(>2 mmol·L-1)氮抑制根系生長[22]。王平等研究指出，氮素利用效率高的小麥品種在根干重、根長、側根數(shù)目方面均高于低氮效的品種[23]。在利用Minirhizophon系統(tǒng)對田間氮肥施用與小麥根系生長的相關性研究發(fā)現(xiàn)，氮肥可以促進小麥根系的生長[24]。Barraclough等曾提出根長密度(RLD，root length density)的概念，即單位體積土壤中的根系長度，來反映作物對土壤中養(yǎng)分吸收的能力。開花期小麥20 cm淺土層的RLD通常為5.6～10 cm·cm-3，而80～100 cm土層RLD為0.4～1.5 cm·cm-3[25]。另有研究表明，小麥氮素吸收的臨界RLD值為1 cm·cm-3(獲得最大氮素吸收的最小根長密度)[18]。不少報道指出小麥根長密度存在基因型差異，但是其與氮素利用的關系的研究還鮮見報道，因此能否利用RLD作為氮素利用效率評價性狀還有待研究。Steele等在水稻根系研究中，通過與根長相關的四個QTL的分子標記輪回選擇創(chuàng)制了一個水稻的近等基因系，其在產(chǎn)量和生物量上均超過了輪回親本[26]。因此，也可以利用與根系性狀相關的QTL對小麥氮高效材料進行分子標記輔助篩選。

3.2小麥氮素的轉運、還原與同化對氮素利用效率的影響

氮素被根系吸收后，由氮素轉運蛋白(ammonium transporters)負責將其跨膜轉運至植物體內，氮素能否高效轉運也是決定氮素利用效率的因素。研究發(fā)現(xiàn)，植物體內硝酸鹽存在低親和、高親和兩套轉運系統(tǒng)[46]。除了基因 AtNRT1.1在兩個轉運系統(tǒng)都發(fā)揮作用外，其余的52個 NRT1基因家族成員均屬于低親和轉運系統(tǒng)成員，負責高濃度(>1 mmol·L-1)氮素環(huán)境的硝酸鹽轉運。它們主要表達在根系皮層( AtNRT1.2)、近木質部根中柱鞘質膜( AtNRT1.5)、葉柄( AtNRT1.4)、果夾液泡( AtNRT1.6)等部位。高親和轉運系統(tǒng)主要負責低濃度( 1 μmol·L-1～1 mmol·L-1) 氮素環(huán)境的硝酸鹽轉運，由 NRT2基因家族成員負責[27]。目前，擬南芥中發(fā)現(xiàn)有7個 NRT2家族基因，而這些基因也主要在根系和莖中表達，這與他們負責氮素的吸收和轉運一致[2]。雖然硝酸鹽是小麥的主要氮素吸收形式，但是銨鹽常作為硝酸鹽之外的植物氮素補充形式。研究發(fā)現(xiàn)植物對銨鹽的吸收主要由AMT轉運蛋白家族成員負責。

氮素被吸收后經(jīng)一系列酶促反應將其還原并同化成可供植物利用的氨基酸。首先，氮素在硝酸還原酶(NR)的作用下在細胞質中被還原成亞硝酸。亞硝酸鹽進而被轉運到質體或者葉綠體中，在亞硝酸還原酶(NiR)的作用下被還原成銨態(tài)氮。然后在質體和葉綠體中，銨態(tài)氮在谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)的作用下被轉化成谷氨酰胺和谷氨酸。合成的氨基酸主要參與植物體內酶和蛋白的合成，進而參與植株光合及形態(tài)建成[28]。因此，與該過程相關的每一環(huán)節(jié)都有可能成為影響作物生長、產(chǎn)量及氮素利用效率的限制因素。雖然NR被認為是氮素還原的關鍵酶，但是多個通過改變NR基因表達的研究結果顯示，并不能對植物生長造成明顯改變，這可能與基因功能的冗余性或者轉錄后的調控相關[29-30]。最近，Vanita等依據(jù)硝酸還原酶活性對幾百份小麥材料進行篩選，選出了高硝酸還原酶活性(HNR)和低硝酸還原酶活性(LNR)小麥種質，其中HNR基因型小麥在氮素收獲量、植株生物產(chǎn)量上均高于LNR基因型小麥，說明較高的硝酸還原酶活性是氮素高效利用的標志之一[31]。

作為氮素同化的關鍵酶，GS活性的提高能大大促進銨離子向氨基酸的合成轉化和氮素向籽粒的轉運，進而提高作物產(chǎn)量，這在很多報道中均得到了證實。Habash (2001) 通過基因工程手段增加了GS基因在小麥旗葉中的表達后，轉基因植株在根系數(shù)量、產(chǎn)量和籽粒氮含量均獲得顯著提升[32]。而在水稻中，突變其中的一個GS基因后，植株的生長和籽粒產(chǎn)量均受到顯著影響[33]。這些研究表明，雖然GS蛋白有不同的異構體，但是單個基因的改變就對植株體產(chǎn)生了較大的影響，說明GS在植株氮素同化和產(chǎn)量形成中起著至關重要的作用，也從另一個方面表明通過對GS活性的調控有可能會改變作物的氮素利用效率，進而促進作物增產(chǎn)的。

3.3小麥花后氮素再分配對氮素利用率的影響

進入灌漿期，小麥植株根系吸收能力逐漸下降，形成籽粒產(chǎn)量所需氮素主要來自營養(yǎng)器官積累的氮素向籽粒的再轉運[34]。小麥籽粒中60%～95%的氮來源于開花前莖葉和根系中儲存的氮素的再轉運[10]。研究表明，小麥營養(yǎng)器官氮素轉運效率的遺傳變異度為0.52～0.92，變異度受環(huán)境、施氮水平的影響較大[25]。但是，對影響氮素向籽粒轉運的調控機制尚不清楚。目前主要觀點認為籽粒氮含量受單位土地面積籽粒產(chǎn)量和蛋白合成能力所決定的籽粒氮需求調控或者是受營養(yǎng)器官的氮供應調控，或者由兩者共同調控，即主動與被動的籽粒氮需求所調控。無論是哪種調控方式，高氮素利用效率的小麥種質都應該具有較高的籽粒氮素轉運效率。

3.4小麥滯綠性與氮素利用效率的關系

滯綠性(stay-green)是指跟普通基因型相比，一個品種在灌漿期能夠保持更久綠色葉面積的能力[35]。葉片衰老性狀對氮素利用有十分重要的作用。在養(yǎng)分充足供應條件下，小麥植株一般衰老緩慢，但是在養(yǎng)分供給受限的情況下，葉片衰老趨于加快，通常會影響籽粒的灌漿。因此，小麥植株葉片在灌漿期保持綠色，可以延緩衰老，進而延長植株光合時間，給地上部生長提供更多養(yǎng)分，同時輸送養(yǎng)分到根系，促進根系對氮素的吸收，最終保證植株體能夠形成最大的干物質生產(chǎn)量。已有研究表明，功能性滯綠與葉綠素和葉綠素結合蛋白的降解相關，降低該類蛋白的降解可以提高作物產(chǎn)量[36]。Spano 等發(fā)現(xiàn)具有滯綠性的硬粒小麥突變體在粒重和最終籽粒產(chǎn)量方面均優(yōu)于對照株系[37]。但也有研究表明，植株的滯綠性通常會導致N素從葉片向籽粒轉運減緩，導致貪青晚熟?？偟膩碚f，植株滯綠性可以延長營養(yǎng)的供給，增加源庫比，從而提高作物產(chǎn)量和NUE，但是又要注意它與氮素轉運的關系，在種質篩選中，要選擇性的平衡二者的關系。

4與小麥氮素利用相關的基因功能發(fā)掘

在模式植物擬南芥中，氮素吸收利用的機理研究已經(jīng)較為透徹，與氮素利用效率相關的基因研究報道較多，而作為多倍體植物，小麥遺傳組成相對復雜，該方面的研究尚處在初級階段。目前的研究主要集中在與氮素相關的QTLs位點的發(fā)掘及少量相關基因的功能研究上。Quarrie等利用含有96個單株的小麥DH系構建了包含567個分子標記的高密度遺傳連鎖圖譜[26]。Habash利用該圖譜將21個與植株性狀、產(chǎn)量、葉片氮素同化等相關的性狀進行了定位，最終發(fā)現(xiàn)了126個相關基因位點，其中一個與GS 活性相關的QTL被共定位在2A染色體的 GS2基因上，而另一個QTL位點則與GSr基因共定位與4A染色體上。同時，還發(fā)現(xiàn)了13個與籽粒氮含量相關的QTL位點分別位于染色體2AS、 4AS、5BS、5DL 和7A端粒的位置，而與葉耳氮含量相關的QTL則被定位于染色體6上[38]。在利用另一個群體構建的圖譜中，F(xiàn)ontaine 主要研究了與氮素利用效率及產(chǎn)量緊密相關的谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)在染色體上的分布，發(fā)現(xiàn)了分別分布于13條染色體的26個與GDH相關和25個與GS相關的QTL位點，其中僅一個與GS相關的QTL位點與位于染色體4B上的GSe基因重合，一個與GDH相關的QTL位點與一個位于染色體2B上編碼GDH基因的位點重合[39]。值得注意的是，這些定位研究均涉及到氮素同化途徑中的GS。氮素利用相關酶的發(fā)現(xiàn)一方面證實了他們研究結果的有效性，另一方面也說明GS在植物氮素利用中的重要作用。為此，Bernard對小麥中的所有GS基因進行了挖掘和序列比對分析，共發(fā)現(xiàn)10個GS基因，并將其聚類分為四個亞家族( GS2、GS1、GSr和GSe)。免疫定位分析將這些基因分別定位在薄壁細胞、韌皮部及中柱鞘細胞上[40]。除了GS基因，氮素代謝GS/GOGAT循環(huán)途徑中的谷氨酸合成酶基因GOGAT也在近期被克隆和鑒定[41-43]。這些研究結果為鑒定和發(fā)現(xiàn)氮素利用途徑中的新基因和位點提供了可能，基因的克隆也有助于利用分子標記輔助選擇氮高效的小麥種質。作為小麥氮素的主要吸收蛋白，包含16個成員的NPF基因家族也被鑒定出來，迥異的組織特異性及空間特異性表達模式說明不只是在模式植物，小麥中可能存在著更為復雜的氮素吸收調控途徑，以幫助植物適應不同的環(huán)境條件[44]。

5傳統(tǒng)育種和分子育種相結合對小麥氮素高效利用品種進行遺傳改良

雖然傳統(tǒng)育種方式已經(jīng)在改良提高小麥新品種的氮素利用效率上取得了較大進展，但是運用生物技術手段對小麥品種進行改良能夠加快育種進程，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向。通過分子育種方式對作物氮素利用性狀進行改良需要在不同氮素水平下鑒定出影響該性狀的主要基因，或者確定影響該性狀的主要位點，然后創(chuàng)制分子標記輔助育種。

目前，研究上主要有三種途徑可以加快對氮素利用效率相關基因的揭示。第一種是通過雜交構建遺傳連鎖圖譜，對于氮素吸收利用相關的農(nóng)藝、生理生化性狀進行QTL定位。第二種是通過轉錄組學的研究，鑒定出對氮素能迅速響應的基因，并進行定位。這些可能是氮素吸收和代謝途徑上的主要基因，或者是與控制氮素利用效率相關的性狀的基因。第三種是通過基因工程的手段，將與氮素高效相關基因導入目標作物載體。例如，C4植物通常擁有比C3植物更高的氮素利用效率，這與C4植物在CO2固定方面特殊的結構和代謝特點相關。Matsuoka等曾將玉米中的一個C4光合基因引入水稻，使其光合效率得到顯著的提高[45]。因此，通過基因工程手段對農(nóng)作物進行改良也是未來農(nóng)業(yè)的一個發(fā)展方向。

總體來說，除了提高栽培技術，田間管理措施外，培育氮高效的新品種是提高小麥氮素利用效率的重要途徑。小麥在進化過程中，為適應不同的環(huán)境條件常發(fā)生自然突變而形成變異新種質。這些新種質蘊含了大量的優(yōu)異遺傳基因。因此，擴大種質資源的搜集范圍，設定不同氮素水平，采用不同條件下的篩選指標對小麥種質進行定向篩選，可以為育種提供較好的親本材料，加快營養(yǎng)高效型小麥新品種的培育。另外，還要盡快建立氮素高效利用表觀性狀或者生理性狀與氮素利用效率的相關性體系，使育種家能夠簡單快速地對品種或者種質的氮素利用情況進行判斷，加快育種進程。同時，通過對氮素吸收同化機制的研究，掌握該過程中影響氮素吸收利用和產(chǎn)量形成的關鍵因子，如氮素代謝途徑中關鍵節(jié)點的基因等，通過基因工程或者分子標記輔助選擇的方式對這些關鍵因子進行調控，進而實現(xiàn)小麥氮素利用效率的提高。最新的研究報道中，小麥的基因組信息已經(jīng)部分釋放[47]，小麥研究正逐步跨入功能基因組及大數(shù)據(jù)分析的時代，借助基因組、轉錄組分析等手段，挖掘與氮素高效利用相關的基因也將為小麥育種研究提供新的發(fā)展契機。

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Research Advances on Nitrogen Use Efficiency (NUE) in Wheat (TritiumaestivumL.) Breeding

XU Qing,XU Fuchao,DONG Jing,QIN Dandan,LI Meifang

(Institute of Food Crops,Hubei Academy of Agriculture Sciences,Wuhan,Hubei 430064,China)

Abstract:Nitrogen is not only an essential macronutrient required for plant growth but also a major limiting factor in determining crop yield. The increases of yield due to the application of nitrogen fertilizers has being considered as the success of modern agriculture in the last decades. However,the over-use of chemical fertilizers like nitrogen has resulted in numerous environmental problems such as water and soil nitrogen pollutions. These concerns raised prompt the breeding scientist to breed new wheat varieties with enhanced nitrogen use efficiency (NUE) to reduce the amount of fertilizers application and the agricultural cost to farmers. In addition,it is also the way to the development of green and sustainable agriculture. Here,we reviewed the research advances in wheat nitrogen use efficiency,including the assessment of nitrogen use efficiency,the genotypic differences for NUE,the morphological and chemi-physiological traits affecting the NUE,the molecular cloning of NUE-related genes,and the combination of traditional and molecular breeding. It is expected that this review will provide assistance to the breeding scientist in wheat NUE research field.

Key words:Wheat; Nitrogen use efficiency (NUE); Germplasm

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)01-0044-07

通訊作者：李梅芳(E-mail:limeifang100@126.com)

基金項目：湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目(2007-620-001-03)；湖北省科技支撐計劃(公益性科技研究)項目(2013BBB07)

收稿日期：2015-07-27修回日期：2015-08-25

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-08

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160108.1821.012.html

第一作者E-mail：xuqinghbaas@163.com