盧立康唑醇質(zhì)體體外抗真菌活性研究

樊建峰 林碧雯 李恒進(jìn)(解放軍總醫(yī)院皮膚科,北京100853)

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盧立康唑醇質(zhì)體體外抗真菌活性研究

樊建峰 林碧雯 李恒進(jìn)
(解放軍總醫(yī)院皮膚科,北京100853)

【摘要】目的 檢測(cè)盧立康唑醇質(zhì)體體外抗菌活性。方法 采用微量液基稀釋法檢測(cè)盧立康唑醇質(zhì)體、脂質(zhì)體、45%水醇溶液對(duì)皮膚癬菌、念珠菌的體外抗菌活性。結(jié)果 盧立康唑醇質(zhì)體對(duì)皮膚癬菌及念珠菌的MIC值低于脂質(zhì)體及水醇溶液,且對(duì)毛癬菌屬較念珠菌屬的MIC值更低。結(jié)論 盧立康唑醇質(zhì)體的體外抗菌性能優(yōu)于脂質(zhì)體及水醇溶液。

【關(guān)鍵詞】盧立康唑醇質(zhì)體;皮膚癬菌;念珠菌;藥物敏感性

[Chin J Mycol,2016,11(1):13-15]

盧立康唑醇質(zhì)體具有較好的滲透性及透皮率,為檢測(cè)盧立康唑醇質(zhì)體、脂質(zhì)體及醇溶液的體外抗真菌活性,本試驗(yàn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)[1-2]所推薦的微量液基稀釋法來(lái)測(cè)定上述制劑的MIC值,用目測(cè)法觀察結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

紅色毛癬菌臨床株(5株)、須癬毛癬菌臨床株(5株)、近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC22019、白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028、白念珠菌臨床株(4 株)、近平滑念珠菌臨床株(4株)、克柔念珠菌臨床株(5株)、光滑念珠菌臨床株(5株),均來(lái)自本院微生物科。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

U型底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(浙江拱東醫(yī)用塑料廠)、麥?zhǔn)媳葷峁?法國(guó)梅里埃公司)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、超凈工作臺(tái)(蘇錦集團(tuán)安泰公司)、分析天平(上海民橋醫(yī)療器械有限公司)。

沙氏培養(yǎng)基(SDA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA本院微生物科),氟康唑(上海三維制藥)、盧立康唑醇質(zhì)體、脂質(zhì)體、45%乙醇水溶液(試驗(yàn)中自制)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

藥物濃度配制 ①用無(wú)菌注射用水稀釋盧立康唑的各種劑型(盧立康唑醇質(zhì)體、盧立康唑脂質(zhì)體、45%盧立康唑乙醇水溶液),使其終質(zhì)量濃度為1 600μg/m L,置于-20℃冰箱中備用。②取1 600 μg/m L藥液用RMPI-1640培養(yǎng)基50倍稀釋,配第1管濃度為32μg/m L。

皮膚癬菌菌懸液配制 ①取1 m L無(wú)菌的0. 85%鹽水加入無(wú)菌試管中,挑取一定量的菌落,用巴氏吸管輕輕抽吸,制成菌懸液。②將菌懸液吸至無(wú)菌試管中,靜置3～5 min后,取上部勻質(zhì)液體(含孢子或菌絲片段),在振蕩器上震蕩15 s。③用無(wú)菌0.85%鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度,使其麥?zhǔn)蠞岫戎嫡{(diào)整至0.5,將此菌懸液用RPMI-1640稀釋50倍得出2倍所需終濃度(0.4×104～5×104CFU/ m L)的菌懸液。

念珠菌菌懸液配制 用RPMI-1640稀釋2 000倍得出終濃度(0.5×103～2.5×103CFU/ m L)的菌懸液。

接種和培養(yǎng) 在96孔板的每孔加入100μL的菌懸液,每次實(shí)驗(yàn)均包括標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028和ATCC6258。念珠菌藥敏板于35℃培養(yǎng),皮膚癬菌藥敏板于28℃培養(yǎng)。

質(zhì)控設(shè)置 采用ATCC22019為念珠菌質(zhì)控菌株,ATCC90028為皮膚癬菌質(zhì)控菌株,每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做其氟康唑抑菌藥敏。只有當(dāng)氟康唑?qū)TCC22019的MIC介于1～4μg/m L,對(duì)ATCC90028的MIC≤0.125～0.5μg/m L方認(rèn)為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。

MIC值判定及結(jié)果 MIC值為肉眼直接觀察到的真菌生長(zhǎng)完全被抑制時(shí)的抗真菌藥物濃度,由于唑類藥物終點(diǎn)不易判定,皮膚癬菌7 d讀結(jié)果, 以50%生長(zhǎng)抑制為MIC終點(diǎn)濃度。念珠菌2 d讀結(jié)果,以80%生長(zhǎng)抑制為MIC終點(diǎn)濃度。

目測(cè)觀察各實(shí)驗(yàn)孔的菌生長(zhǎng)量 ①清晰(100%被抑制生長(zhǎng))。②略模糊(80%被抑制生長(zhǎng))。③濁度顯著減低(50%被抑制生長(zhǎng))。④濁度輕度減低(20%被抑制生長(zhǎng))。⑤濁度未減低(0%被抑制生長(zhǎng))。

2 結(jié) 果

盧立康唑醇質(zhì)體及其對(duì)照制劑的MIC結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

盧立康唑醇質(zhì)體與脂質(zhì)體對(duì)上述各菌的MIC值低于盧立康唑水醇溶液(P＜0.01),盧立康唑醇質(zhì)體與脂質(zhì)體對(duì)上述各菌MIC值比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮與樣本量低有關(guān)。參照?qǐng)D1盧立康唑不同劑型對(duì)念珠菌菌株MIC值:醇質(zhì)體＜脂質(zhì)體＜水醇溶液;盧立康唑不同劑型對(duì)紅色毛癬菌及須癬毛癬菌菌株MIC值:醇質(zhì)體/脂質(zhì)體＜水醇溶液。另外,盧立康唑?qū)γ_菌屬較念珠菌屬相比MIC值低,更敏感。

3 討 論

盧立康唑是新型抗真菌藥物,有抗菌活性強(qiáng)、起效快等優(yōu)點(diǎn),且中國(guó)市場(chǎng)并未使用,目前也無(wú)醇質(zhì)體制劑。因此我們選取其為主藥,進(jìn)行醇質(zhì)體抗菌性研究。目的在于加強(qiáng)主藥的抗菌能力,使其發(fā)揮更大的抗菌作用。盧立康唑脂質(zhì)體體外實(shí)驗(yàn)中, Koga等[3]用肉湯微量稀釋法比較了盧立康唑與其他9種藥物(特比萘芬、利拉萘酯、布替萘芬、阿莫羅芬、酮康唑、克霉唑、奈康唑、咪康唑和聯(lián)苯芐唑)的抗菌活性,顯示盧立康唑?qū)γ_菌屬有較強(qiáng)的抗菌活性。

圖1 盧立康唑不同劑型最低抑菌濃度Fig.1 The MICs of luliconazole ethosome,liposome and hydroalcoholic solution

真菌感染一般分為淺部真菌感染和深部真菌感染。在我國(guó),毛癬菌屬中的紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、紫色毛癬菌是體股癬、手足癬的常見(jiàn)致病菌[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)主要選取白念珠菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等作為研究菌株,檢測(cè)盧立康唑醇質(zhì)體及各種對(duì)照劑型MIC值,初步評(píng)價(jià)其體外抗真菌活性。

由于皮膚角質(zhì)層屏障的存在,一般經(jīng)皮外用藥難以攜帶大量藥物進(jìn)入皮膚深層,達(dá)到理想的抗菌效果。劉利萍等[6]制備的克霉唑醇質(zhì)體,體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)白念珠菌的最低抑菌濃度值是克霉唑脂質(zhì)體的50%,是游離克霉唑乙醇水溶液的12.5%,最低殺菌濃度的變化趨勢(shì)與最低抑菌濃度類似,醇質(zhì)體組殺菌所需克霉唑劑量明顯低于脂質(zhì)體組。另外,在殺菌起效方面,克霉唑醇質(zhì)體明顯優(yōu)于脂質(zhì)體和乙醇水溶液。最低抑菌濃度、最低殺菌濃度和抗菌-時(shí)效實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一方面也證明了醇質(zhì)體比脂質(zhì)體具有更快的透過(guò)速率、更高的滲透能力和更短的時(shí)滯,從而使藥物能夠更快和更好的發(fā)揮抗菌作用,有助于深層真菌感染的治療。鹽酸阿莫羅芬醇質(zhì)體經(jīng)共聚焦激光掃描顯微鏡實(shí)驗(yàn)表明,醇質(zhì)體與脂質(zhì)體及乙醇溶液相比,可更有效增加藥物的透皮量和穿透深度,增加藥物在皮膚中的滯留量[7]。

表1 盧立康唑不同劑型最低抑菌濃度Tab.1 The MICs of luliconazole ethosome,liposome and hydroalcoholic solution

本試驗(yàn)中盧立康唑醇質(zhì)體對(duì)七種菌株的MIC值均低于盧立康唑其他對(duì)比劑型(脂質(zhì)體、水醇溶液),考慮可能與醇質(zhì)體穿透機(jī)制中細(xì)胞內(nèi)傳遞有關(guān)。它可攜帶藥物直接透過(guò)細(xì)胞膜將藥物釋放到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。盧立康唑軟膏不能溶于水,無(wú)法均勻分散在水中,因此未選取其作為對(duì)照。對(duì)白念珠菌及其他四種念珠菌的MIC值均低于脂質(zhì)體及水醇溶液,對(duì)紅色毛癬菌及須癬毛癬菌的MIC值也低于水醇溶液。與其他研究中克霉唑和阿莫羅芬的醇質(zhì)體制劑的體外抗真菌活性較脂質(zhì)體和水醇溶液強(qiáng)是一致的。但因選取菌株較少,樣本量低,造成抑菌濃度范圍接近,且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,所以在下一步盧立康唑醇質(zhì)體對(duì)豚鼠真菌模型上的療效觀察之前,應(yīng)收集大量菌株,重復(fù)體外抑菌實(shí)驗(yàn)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)盧立康唑?qū)t色毛癬菌、須癬毛癬菌較念珠菌敏感程度高,這與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致。

參考文獻(xiàn)

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[本文編輯]施 慧

·論著·

The antifungal susceptibility test in vitro of luliconazole ethosomes

FAN Jian-feng,Lin Bi-wei,Li Heng-jin
(PLA General Hospital Department of Dermatology,Beijing 100853,China)

【Abstract】Objective To study antifungal susceptibility of luliconazole ethosomes in vitro.Methods In vitro,antifungal activity of luliconazole ethosome,liposome,hydroalcoholic solution:MICs were determined using the micro-broth dilution assay.Results The MIC of the luliconazole ethosome was lower than that of liposome form or hydroalcoholic solution form.The MIC of luliconazole ethosome to Trichophyton spp.was lower than the sensitive degree to Candida spp.Conclusions In vitro,the antifungal effect of luliconazole ethosome is better than luliconazole liposome or its hydroalcoholic solution.

【Key words】luliconazole ethosomes;dermatophytes;Candida;antifungal succeptibility

[收稿日期]2014-12-10

通訊作者:李恒進(jìn),E-mail:lhengjin@163.com

作者簡(jiǎn)介:樊建峰,男(漢族),碩士,副主任醫(yī)師.E-mail:fanjianfeng1@tom.com

【中圖分類號(hào)】R 978.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-3827(2016)11-0013-03