梁雪瑩 景欽隆 李意蘭 曹 慶 魏躍紅 羅 雷
廣州市2009-2010年DENV-3型病毒分子生物學(xué)特征分析
梁雪瑩 景欽隆 李意蘭 曹 慶 魏躍紅 羅 雷
目的探討廣州市DENV-3型病毒的基因變異及傳播模式,為登革熱疫情防控提供科學(xué)建議。方法對2009-2010年采集的疑似登革熱病例早期血標(biāo)本進(jìn)行檢測RT-PCR,陽性標(biāo)本血清接種至C6/36細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。對登革病毒E基因進(jìn)行測序,并與基因庫中全球和中國其他省份DENV-3代表病毒株進(jìn)行比對,對廣州病毒分離株的來源和同源性進(jìn)行分析。結(jié)果共分離獲得13份DENV-3型病毒樣本(2009年7份,2010年6 份),基因樹系譜分析顯示DENV-3型病毒包括3個基因型(Ⅰ,Ⅲ,Ⅴ),其中基因Ⅰ型來源于印度尼西亞,基因Ⅲ型的2個節(jié)點(diǎn)族中,A節(jié)點(diǎn)族來源于科特迪瓦,B節(jié)點(diǎn)族來源于坦桑尼亞,基因型Ⅴ來源于菲律賓。2009年和2010年病毒株E基因核酸分別存在1.3%~9.0%和0.5%~3.9%的差異。結(jié)論2010年分離病毒株并非2009年的延續(xù),不同基因型的DENV-3型病毒可能是通過不同的地理路徑傳入。
登革熱;DENV-3型;分子生物學(xué)
【Author's address】Guangzhou Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 510440,China
登革病毒(Dengue Virus)是黃病毒屬中的一個血清型亞群,形態(tài)結(jié)構(gòu)與乙腦病毒相似,體積約17~25 nm,依抗原性不同分為1、2、3、4四個血清型,同一型中不同毒株也有抗原差異[1]。感染登革病毒后可引發(fā)不同的臨床表現(xiàn)[2],重癥者甚至出現(xiàn)登革出血熱或登革休克綜合癥[3-4]。1980年廣州市范圍內(nèi)首次分離出DENV-3型病毒,隨后四型登革熱在廣州相繼出現(xiàn),2000年后,廣州登革熱暴發(fā)多由DENV-1引起。但DENV-3型在2009和2010年再次被分離出,且引發(fā)了較大規(guī)模的暴發(fā)流行[5]。連續(xù)兩年同型登革病毒的流行提示廣州可能存在本地化的風(fēng)險,而現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查無法證實(shí)上述風(fēng)險。因此,為探明DENV-3型病毒在廣州流行的分子生物學(xué)特征判斷兩年同一血清型登革病毒暴發(fā)疫情是否由同一基因型別引起,特對2009年和2010年所獲得的DENV-3型病毒E基因全序列進(jìn)行全面的分析?,F(xiàn)報道如下。
1.1 病例及標(biāo)本采集
2009-2010年間通過主動和被動監(jiān)測累計診斷登革熱病例55例,每例病例均采集急性期外周血5 mL,6 h內(nèi)送實(shí)驗室進(jìn)行登革病毒實(shí)驗室檢測。
1.2 病毒株獲取
陽性血標(biāo)本1∶10稀釋后取100 μL接種C6/36白蚊伊蚊傳代細(xì)胞,吸附1 h后棄去上清,加入含15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,置34℃孵箱中培養(yǎng),7 d后傳代,以出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)殛栃裕B續(xù)傳代3次均無細(xì)胞病變則判斷為陰性。在細(xì)胞病變達(dá)+++時取細(xì)胞培養(yǎng)液上清,-70℃凍存[6]。
1.3 RNA提取和擴(kuò)增
取病變細(xì)胞培養(yǎng)上清140 μL,用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取登革病毒RNA。用PrimeScript One-Step RT-PCR(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),反應(yīng)條件如下:50℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄,94℃2 min變性,94℃30 s,55℃30 s,72℃3 min,35個循環(huán),最后72℃保溫7 min。用TBE緩沖液配制含0.5 μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠,取5 μL PCR產(chǎn)物,與1 μL上樣緩沖液混和,在TBE緩沖液中以80 V恒壓電泳1 h,在透射式紫外分析儀上觀察,出現(xiàn)特異性條帶為陽性。
1.4 E基因序列測定與同源性分析
擴(kuò)增的DENV-3型病毒DNA經(jīng)純化后采用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen,Germany)進(jìn)行序列測定。測定后的各片段序列采用Seqman II程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI,USA)進(jìn)行拼接并組裝成完整的E基因組序列,經(jīng)過核對校正后上傳至GenBank。序列測定所用引物見表1。采用BLAST引擎對核苷酸百分比和氨基酸一致性進(jìn)行同源性比對;應(yīng)用Clustal X v.1.83軟件進(jìn)行序列多重比對,然后運(yùn)用MEGA 4.0軟件采用Kimura校正模型的領(lǐng)接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。
表1 用于DENV-3 E基因全序列擴(kuò)增和測序引物
2.1 分離獲得病毒株情況
55例病例中17份標(biāo)本RT-PCR檢測陽性,共分離獲得13株DENV-3病毒,其中2009年7株,2010年6株,病毒株 E基因序列均上傳至 Gen-Bank,各病毒株基本信息及上傳序列號,見表2。
表2 廣州2009-2010年13株DENV-3病毒分離株基本信息
2.2 核苷酸和氨基酸序列比較
除10/GZ/10549病毒株外,2010年的其余5株DENV-3分離株非常近似,核苷酸和氨基酸一致性分別為99.5%~100%與98.7%~100%。2009年3株分離株(09/GZ/1483,09/GZ/10806,09/GZ/ 1081)表現(xiàn)出高度一致,核苷酸和氨基酸一致性均超過 99.7%。2009年其余 3株病毒(09/GZ/ 10616,09/GZ/11144,09/GZ/11194)與 09/GZ/ 13105分離株相似度較低(核苷酸一致性在99.3%~99.5%之間,氨基酸一致性在98.9% ~99.1%之間)。然而,2009年與2010年病毒分離株核苷酸和氨基酸差異分別在1.3% ~9.0%和0.5%~3.9%之間,提示兩年分離獲取的13株DENV-3可能來自不同的地區(qū)。13株DENV-3病毒E基因核苷酸百分比和氨基酸一致性見表3。
2.3 基因序列進(jìn)化分析
從GenBank檢索出90株代表全球不同地區(qū)DENV-3病毒E基因序列(表4),與廣州2009年和2010年的13株DENV-3病毒E基因序列繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖1),結(jié)果顯示廣州13株DENV-3病毒株分屬DENV-3型病毒的I、III和V基因亞型,其中2010年僅1株分離(10/GZ/10549)屬于I基因亞型,與2004至2007年印度尼西亞分離株相近似,3株2009年分離(09/GZ/1081,09/GZ/1483,和09/GZ/10806)屬于V基因亞型,這與廣西1980年分離株近似。其余9株病毒均分屬III基因亞型,且可分為A和B兩個節(jié)點(diǎn)族,A節(jié)點(diǎn)族包括2009 年 4株 (09/GZ/11144,09/GZ/11194,09/GZ/ 10616和09/GZ/13105),B節(jié)點(diǎn)族包括2010年5株分離株(10/GZ/4898,10/GZ/5536,10/GZ/9119,10/GZ/9534,和10/GZ/9721),這些毒株系統(tǒng)發(fā)生樹與2010年坦桑尼亞分離株相近似。
表3 2009-2010年廣州13株DENV-3病毒株間核苷酸和氨基酸一致性百分比
表4 用于E基因測序分析的DENV-3病毒參考株
DENV-3病毒最初在1956年菲律賓暴發(fā)疫情中分離到[8],之后該血清型迅速地擴(kuò)散至全球各地。截止目前,DENV-3可分為4~5個基因亞型。I~I(xiàn)II基因亞型是DENV-3感染的主要基因型,且與東南亞、印度次大陸、東非和美洲的DF/DHF發(fā)生有關(guān)。DENV-3病毒中的III基因亞型被認(rèn)為可能具有更強(qiáng)的傳播效率[9],甚至更易導(dǎo)致登革出血熱的發(fā)生,一旦該基因亞型在局部地區(qū)形成傳播流行,其很快將導(dǎo)致跨區(qū)域的大流行[10]。
廣州近10年均為DENV-1流行,2009年和2010年流行的DENV-3是距1980年29年之后的再現(xiàn)[3],系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果顯示2009年和2010年雖然均分離到III基因亞型病毒株,但兩年的病毒株卻分屬兩個不同的節(jié)點(diǎn)族(節(jié)點(diǎn)A和節(jié)點(diǎn)B),兩者之間的病毒株核苷酸的一致性相對較低(97.7%~98.7%),尚不能證明兩年之間的流行存在關(guān)聯(lián)。相反,廣州市分離到的病毒株與境外發(fā)現(xiàn)病毒株存在高度同源性:A節(jié)點(diǎn)族與2008年科特迪瓦分離株更相近,2010年5株病毒與坦桑尼亞2010年分離株AB549332共同組成B節(jié)點(diǎn)族,提示兩年的DENV-3型病毒可能來源于不同的國家或地區(qū),DENV-3病毒可能存在多條輸入途徑進(jìn)入廣州,既往研究顯示2010年3株白云區(qū)分離株,1株南沙區(qū)分離株和1株越秀區(qū)分離株與坦桑尼亞2010年分離株近似,而2010年番禺區(qū)分離株印度尼西亞病毒株相近似[5,6,10]。隨著國際旅游和對外貿(mào)易的發(fā)展,登革病毒跨國傳播風(fēng)險也急劇增加。因此,在今后的防控工作中,應(yīng)在機(jī)場等出入境關(guān)口建立切實(shí)有效的發(fā)熱病例篩檢系統(tǒng)及時發(fā)現(xiàn)可疑輸入性病例以及加強(qiáng)登革病毒的實(shí)驗室監(jiān)測以及時發(fā)現(xiàn)早期輸入病例[11]。輸入病例進(jìn)入廣州后未得到有效控制是境外基因亞型DENV-3病毒在廣州流行的重要原因,因此病例監(jiān)測系統(tǒng)的靈敏性和輸入病例控制的能力也亟待提高。
綜上所述,2009和2010年廣州登革疫情并非同一流行株的連續(xù)傳播或2009年毒株在2010年的再現(xiàn),不同基因型的DENV-3型病毒可通過不同的地理路徑傳入,DENV-3不同基因亞型毒株的反復(fù)輸入是引發(fā)廣州2009年和2010年登革熱暴發(fā)流行的主要因素,分子流行病學(xué)研究提示DENV-3在廣州的再現(xiàn)流行尚未表現(xiàn)出本地化的趨勢。雖然對獲取到的所有病毒株進(jìn)行了同源性分析,但由于僅有13份病毒株,本研究的結(jié)論仍需大樣本的驗證,在今后的研究中,將繼續(xù)加強(qiáng)廣州登革熱病例監(jiān)測和登革病毒分離培養(yǎng)工作,進(jìn)一步探討輸入病例在本地的傳播模式,同時驗證登革熱是否存在本地化的趨勢。
[1] 張守平,汪 明.登革熱研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,48 (10):61-63.
[2] 方 明,麥柏堅,蕭翠萍.發(fā)熱并白細(xì)胞計數(shù)正常或減少238例臨床分析[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2014,14(8):46-50.
[3] 潘越峻,張 媛,鄧西龍.重癥登革熱合并肺部改變患者臨床特征分析[J]現(xiàn)代醫(yī)院,2016,16(4):501-503.
[4] 王天舒,楊蘭清,盧海清.重癥登革熱患者炎癥因子的變化特征[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2015,15(3):58-59.
[5] LUOL,LIANG H Y,HU Y S,LIU W J,et al.Epidemiological,virological,and entomological characteristics of dengue from1978 to 2009 in Guangzhou,China[J].J Vector Ecol,2012(37):230-240.
[6] JING Q L,YANG Z C,LUO L,et al.Emergence of dengue virus 4 genotype II in Guangzhou,China,2010:survey and molecular epidemiology of one community outbreak[J].BMC Infect Dis,2012(12):87.
[7] HUANG M,ZHANG Y J,LIN M Q,et al.Sequence analysis of envelope genes in dengue viruses from Fujian province,2004-2010[J],Chinese Journal zoonoses,2012,28(10):973-977.
[8] 陳艷佳,熊建英,朱 利,等.4種血清型登革病毒NS1蛋白序列及B細(xì)胞抗原表位特異性分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(1):117-123.
[9] 鄧 掌,張海林.全球登革熱和登革出血熱流行狀況及防治研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2009,9(12):2318-2321.
[10]JIANG T,YU X D,HONG W X,et al.Co-circulation of two genotypes of dengue virus serotype 3 in Guangzhou,China,2009 [J].Virol J,2012,9:125.
[11]吳 烽,鐘玉清,陳胤瑜,等.登革熱傳入性風(fēng)險評估指標(biāo)體系的研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,33(10):1964-1966.
The Molecular Characteristics of Envelope Gene of DENV-3 in Guangzhou During from 2009 to 2010
LIANG Xueying,JING Qinlong,LI Yilan,et al
Objective To explore the variation and transmission pattern of DENV-3 in order to provide scientific suggestions for control and prevention dengue fever.MethodsRT-PCR test was conducted in blood samples collected from suspected dengue fever cases during 2009 and 2010.Positive serum was arranged for viral culture on C6/36 cell.The envelope(E)genes of viruses were sequenced and compared with previously published E gene sequences of global representative DENV-3 strains available in GenBank,which also included isolates circulating in other provinces of China.ResultsA total of 13 isolates(7 from 2009 and 6 from 2010,respectively)were obtained from human serum samples.Phylogenetic analysis revealed that the isolates were grouped into three genotypes(I,III,V)and then two clades within genotype III(genotype I from Indonesia,genotype III clade A from Cote dIvoire,genotype III clade B from Tanzania and genotype V from Philippines).In addition,there were 1.3%-9.0%and 0.5%-3.9%differences in the nucleic and deduced amino acid sequences between the 2009 and 2010 strains,respectively.ConclusionsThe DENV-3 viruses from 2009 to 2010 may not come from the continuous spread of an epidemic strain or the re-emergence of the 2009 strains in the 2-year period.The introduction of different DENV-3 genotypes following more than one geographical route may be an important contributing factor during 2009-2010 dengue epidemics in Guangzhou.
Dengue;DENV-3 serotype;Molecular Biology
R181.2+4
A
10.3969/j.issn.1671-332X.2016.09.005
廣東省自然科學(xué)基金(編號:2015A030313784);傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗室項目(編號:2014SKLID308);廣東省科技計劃項目(編號:2013A020229006;2013A020229005)
梁雪瑩 景欽隆 李意蘭 曹 慶 魏躍紅 羅 雷:廣州市疾病預(yù)防控制中心 廣東廣州 510440
羅 雷