豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測方法研究進展

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測方法研究進展

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

文章綜述了豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測方法，主要包括核酸探針、普通RTPCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增等6種方法，對豬傳染性胃腸炎病毒病的防控有一定的參考價值。

豬傳染性胃腸炎病毒；分子生物學(xué)；檢測方法

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine,TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征高度傳染性疾病[1]，秋始、冬春為該病高發(fā)期。該病最初發(fā)生在美國，隨后世界各地均有相關(guān)報道，我國20世紀(jì)50年代首次報道TGE，1956年中國臺灣省分離到TGEV，目前我國大部分地區(qū)都有該病發(fā)生流行，各種不同品種和月齡的豬都能感染TGEV發(fā)病，2周齡受到的危害最為嚴(yán)重，一旦感染后，其死亡率可高達(dá)100%。5周齡以上的豬感染后雖然死亡率不高，但生長緩慢，飼料利用率低，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類疾病中必檢的傳染病[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的檢測方法，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病毒病和細(xì)菌病的檢測，具有很好的發(fā)展前景。本文綜述了TGEV的分子生物學(xué)檢測方法，為TGE的診斷和防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針檢測方法的原理是核苷酸堿基順序互補，采用標(biāo)記物標(biāo)記一段可與被測定的靶序列互補單鏈核酸分子，從而檢測目的核酸序列。Kim等[3]用地高辛標(biāo)記TGEV核衣殼蛋白cDNA基因序列，制備探針，建立了檢測TGEV的核酸探針方法，對25份臨床樣品進行檢測，陽性率為81%，該法與病毒分離、熒光抗體試驗、掃描電鏡等方法相比，特異性較好，可實現(xiàn)對病毒的快速檢測。史喜菊等[4]分別設(shè)計了豬流感病毒（SIV）、偽狂犬病病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等5種病毒的多重連接探針擴增技術(shù)（MLPA）探針，將這5種探針混合，建立了可以同時檢測這5種病毒的MLPA擴增方法。方法特異性試驗表明，針對每種病毒的探針都只能擴增出其對應(yīng)的病毒模板，其余病毒模板擴增的結(jié)果都是陰性，而且5種探針混合物都只能從單個目的病毒中擴增出單一的特異性條帶，而豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的擴增均為陰性。敏感性試驗結(jié)果表明，5重MLPA擴增的最低檢測限可以達(dá)到單個病毒核酸3 000～6 000個拷貝。

2 普通RT-PCR方法

參照已知的病原相關(guān)目的基因序列，用軟件設(shè)計引物，采用相關(guān)的試劑和儀器體外大量擴增目的基因，是一種快速的分子生物檢測方法。王黎等[5]成功建立了檢測TGEV的RT-PCR方法。以等量同一濃度的同一TGEV陽性病毒液進行重復(fù)性試驗，其3次擴增特異性條帶大小均為590 bp。以豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（RV）進行特異性試驗，其結(jié)果顯示僅TGEV擴增得到預(yù)期特異性目的條帶。以TGEV陽性病毒液提取的cDNA用紫外分析儀確定核酸質(zhì)量濃度為1 g/L后，用ddH2O按10倍稀釋，稀釋度為10-1～10-5，其均能擴增出590 bp特異性條帶。張作華等[6]試驗根據(jù)GenBank中登錄的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）N基因序列設(shè)計了1對特異性引物，建立一種TGEV的RT-PCR檢測方法，結(jié)果表明：該方法具有高度的特異性和較好的重復(fù)性，可檢測到1× 10-3μg/μL的TGEV DNA，并可用于臨床上TGEV感染引起的傳染病病原學(xué)的檢測。

3 套式RT-PCR方法

套式PCR方法是設(shè)計內(nèi)、外2對引物，通過2次擴增對樣品檢測，該法節(jié)省時間和試劑用量，且敏感性較高。沈海娥等[7]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒的S基因核苷酸序列，設(shè)計合成了2對引物，以豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)物為模板，進行PCR特異性片段擴增，豬傳染性胃腸炎病毒擴增片段大小為886 bp，豬呼吸道冠狀病毒擴增片段大小為214 bp。王玉潔等[8]根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）基因序列，利用Primer5.0程序軟件，設(shè)計并合成了M基因的2對引物，以mRNA為模板，通過RT-PCR、RT-nested PCR方法，成功擴增出長度為1 328 bp和1 037 bp的TGEV目的片段，但未擴增出豬流行性腹瀉病毒（PEDV）片段。在優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了快速檢測TGEV的診斷方法。母文華等[9]根據(jù)GenBank中收錄的TGEV，纖突蛋白S基因的核酸序列設(shè)計了2對引物，以mRNA為模板，通過RT-PCR、RT-nested PCR方法，在優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了快速檢測TGEV的RT-nested PCR診斷方法。試驗結(jié)果成功擴增出長度為886 bp和690 bp的TGEV目的片段，但未擴增出豬流行性腹瀉病毒（PEDV）片段。

4 多重RT-PCR方法

多重PCR檢測方法是在普通PCR檢測方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可以實現(xiàn)在一個PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，能同時檢測多種病原，可節(jié)約成本，節(jié)省時間，目前也廣泛用于臨床各種疾病的快速診斷。郭容利等[10]建立了一種同時檢測PEDV、TGEV和豬A群輪狀病毒（PARV）的三重RT-PCR方法，并對其進行特異性與敏感性試驗，該法能檢測約50TCID50的混合病毒，能夠擴增出3條長度為750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特異性片段，而其他病毒無特異性條帶。吳洋等[11]建立了可同時檢測PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR擴增，結(jié)果顯示，該方法可以同時擴增PEDV（682 bp）、TGEV（480 bp）和RV（297 bp）的特異性DNA片段，而對豬瘟病毒和豬偽狂犬病病毒的PCR擴增結(jié)果均為陰性，該法對PEDV、TGEV和RV檢測的最低拷貝數(shù)分別為3.3×103拷貝/μL、3.2×103拷貝/μL和2.8×103拷貝/μL。鄭世民等[12]根據(jù)GenBank中TGEV和PEDV的S蛋白基因序列分別設(shè)計1套特異性引物，建立了TGEV和PEDV的RT-PCR快速檢測方法，該法對TGEV和PEDV擴增的目的片段的大小分別為426bp和583bp，經(jīng)優(yōu)化確立最佳反應(yīng)體系：引物、氯化鎂和dNTP濃度分別為8、9和14 μmol/L，退火溫度為54℃。賈銳等[13]根據(jù)GenBank中已登錄的TGEV、PEDV的序列，利用Primer5.0計合成了2對特異性引物。用這2對引物對TGEV、PEDV cDNA模板首先進行單項PCR條件優(yōu)化，然后采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化多重RTPCR反應(yīng)條件，結(jié)果同時擴增到2條與試驗設(shè)計相符的492 bp（PEDV）和211 bp（TGEV）特異性條帶，建立了能夠同時檢側(cè)2種病毒混合感染的特異、靈敏的多重PCR檢側(cè)方法，可檢側(cè)出約11 pg的PEDV和13 pg的TGEV。徐引弟等[14]建立了可同時檢測PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法，該法能同時檢測PEDV、TGEV、RV，而對CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PPV等無擴增，檢測的抗原稀釋極限為107。

5 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量PCR檢測方法是在反應(yīng)體系中加入SYBR GreenⅠ熒光染料或用熒光探針標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物，然后根據(jù)反應(yīng)儀器收集熒光信號的強弱來確定產(chǎn)物的量，從而實現(xiàn)對起始模板進行準(zhǔn)確定量，與常規(guī)RT-PCR相比，不需要電泳檢測，就可以檢測樣品，更方便、直觀，可減少產(chǎn)物對環(huán)境的污染。王慧珊等[15]建立了能鑒別檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，該法能同時檢測這兩種病毒，通過與常規(guī)RT-PCR試驗比較表明，所建立的熒光RT-PCR檢測技術(shù)快速、敏感，檢測時限3 h以內(nèi)，具有很好的特異性和重復(fù)性。董玲娟等[16]建立了TGEV熒光定量RT-PCR檢測方法，該法特異性高、重復(fù)性好、敏感性比普通PCR檢測方法高2個數(shù)量級，對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的線性檢測范圍為1.0×107～1.0×101拷貝/μL。用建立的檢測方法對從陜西楊凌周邊豬場采集的30份樣品進行檢測，檢出1份陽性，與普通PCR檢測方法符合率為100%。王建中[17]參照GenBank登錄的TGEV S基因序列設(shè)計引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測TGEV的熒光定量PCR檢測方法，結(jié)果顯示，該法具有良好的特異性，對其他病原的檢測結(jié)果為陰性，其檢測敏感性可達(dá)43.07拷貝/μL，是普通RT-PCR檢測方法的100倍。張雪等[18]建立一種基于SYBR GreenⅠ來進行檢測TGEV的實時熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，擴增效率為103%，相鄰擴增曲線之間間距均勻，所有產(chǎn)物的熔解曲線具有單一整齊的峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有優(yōu)良的線性關(guān)系，最低可準(zhǔn)確檢測63拷貝/μL的核酸模板，重復(fù)性試驗的變異系數(shù)小于3%。用建立的PCR對3種常見豬源RNA病毒的檢測結(jié)果均為陰性，對65份臨床樣品的檢出率高于常規(guī)PCR。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增檢測方法（LAMP）是一種新興的分子生物學(xué)檢測方法，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌病和病毒病的檢測，該法具有檢測速度快、敏感性好、特異性高且操作比較簡單等特點，適合基層獸醫(yī)部門的應(yīng)用。高睿澤等[19]建立針對TGEV N基因的RT-LAMP快速檢測方法，并對該檢測方法的特異性與靈敏性進行了評價。該方法在63℃恒溫下作用50 min，使TGEV N基因獲得了高效率特異性擴增，與豬流行性腹瀉病毒等其他豬易感病毒無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性，同時該方法具有很高的靈敏性，可檢測到131.4 fg/μL的目標(biāo)病毒DNA，比普通PCR的靈敏度高3個數(shù)量級。反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR GreenⅠ在紫外燈下觀察顏色變化，結(jié)果顯示陽性擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光。

7 小結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各國專家、學(xué)者先后建立了多種TGEV分子生物學(xué)檢測方法，但這些方法各有利弊，普通RT-PCR、套式RT-PCR和多重RT-PCR等方法雖然檢測簡單、快速、方便，但不能精確定量，且敏感性有限，容易漏檢。熒光定量RTPCR檢測方法彌補了普通PCR方法的缺點，但所用器材和試劑成本高，且對操作人員有很高的要求，不利于其在基層獸醫(yī)部門大規(guī)模推廣應(yīng)用。LAMP方法是一種新興的方法，不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡便，更適合基層應(yīng)用。單獨使用任何一種方法都很難正確診斷該病，做好將各種方法結(jié)合起來，綜合判斷，不同部門應(yīng)該根據(jù)自己的實際情況選擇相應(yīng)的方法，相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，在不久的將來會有更多新型分子生物學(xué)診斷方法建立，從而為豬傳染性胃腸炎病毒病的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查和防控提供保障。

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（編輯：郭玉翠）

五種食物可防胃病癌變

大蒜流行病學(xué)調(diào)查顯示，常食用生大蒜的人群，胃癌發(fā)病率非常低，原因是大蒜中的大蒜素可抑制胃中的硝酸鹽還原菌，使胃內(nèi)的亞硝酸鹽明顯降低，減少了亞硝酸胺合成的可能，因而起到防癌效果。

洋蔥吃洋蔥能降低胃中亞硝酸鹽含量，重要的是洋蔥中含有一種櫟皮素的物質(zhì)，為天然的抗癌物質(zhì)。研究顯示，經(jīng)常吃洋蔥的人，胃癌發(fā)病率比少吃或不吃洋蔥的人要少25%。

菌菇類這類食物包括冬菇、香菇、金針菇等以及木耳?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，食物中許多菌菇類都含有抗癌物質(zhì)，具有防癌功效。

番茄番茄含番茄紅素及胡蘿卜素，它們都是抗氧化劑，特別是番茄紅素，能中和體內(nèi)自由基，對于抗胃癌和消化系癌有利，同時對預(yù)防乳腺癌和前列腺癌也有效。

椰菜花椰菜花中含較多微量元素鉬，可阻斷致癌物質(zhì)亞硝酸胺的合成，能起到抗癌防癌作用。

（轉(zhuǎn)自《養(yǎng)生》，2016年第1期）

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0118-03

2016-01-03

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2013CQ006）；山東省自然科學(xué)基金青年基金項目（ZR2014CQ010）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷研究.E-mail：517493935@qq.com