轉(zhuǎn)基因植物DNA成分檢測技術(shù)研究進(jìn)展

林馥芬 侯紅利，2 劉 晉，2 王學(xué)林，2 鄧漢超，2 周向陽，2

（1廣東省深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，深圳518040；2農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（深圳），深圳518040）

轉(zhuǎn)基因植物DNA成分檢測技術(shù)研究進(jìn)展

林馥芬1侯紅利1，2劉 晉1，2王學(xué)林1，2鄧漢超1，2周向陽1，2

（1廣東省深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，深圳518040；2農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（深圳），深圳518040）

綜述了轉(zhuǎn)基因植物的DNA成分定性、定量檢測，基因芯片檢測技術(shù)的原理和特點(diǎn)，初步探討未知轉(zhuǎn)基因核酸成分檢測技術(shù)研究狀況，最后指明轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù) 的發(fā)展依賴于 現(xiàn)代分子 生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，并朝著低成本、自動化、高靈敏度、高特異性、高通量的方向發(fā)展。

轉(zhuǎn)基因；PCR；DNA

自從1996年第1個轉(zhuǎn)基因番茄商業(yè)化種植后，世界各國開始快速地發(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)業(yè)得到迅速擴(kuò)展，并給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)收益。據(jù)統(tǒng)計，20年中（1996-2015年）全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積已經(jīng)達(dá)到20億hm2，比我國大陸總面積（9.56億hm2）和美國總面積（9.37億hm2）的總和還多[1]。但公眾對轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品的認(rèn)識不夠，對轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的安全性存在擔(dān)憂；雖然我國強(qiáng)制性要求標(biāo)識轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，但是在標(biāo)識水平上沒有明確說明標(biāo)識的最低范圍。因此，應(yīng)更進(jìn)一步地學(xué)習(xí)和探索轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)，以便更加科學(xué)地管理我國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

1 定性PCR檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用

1.1 常規(guī)PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用 常規(guī)PCR（common PCR）檢測是針對特殊序列（如啟動子、終止子和遺傳標(biāo)記基因）和目的基因（靶基因）設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離、核酸染料染色（如EB、GoldenView等）、紫外成像，判斷電泳圖像是否含有特異目的條帶。T.Matsuoka等[2]對轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因進(jìn)行序列分析，設(shè)計針對7種轉(zhuǎn)基因玉米14對特異引物，引物包含轉(zhuǎn)基因玉米啟動子、終止子和結(jié)構(gòu)基因。利用設(shè)計的引物對轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆、水稻、大麥和小麥等進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)設(shè)計的引物采用PCR的方法能夠快速、準(zhǔn)確、特異、有效地檢測轉(zhuǎn)基因玉米種子。

1.2 巢式和半巢式PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用 巢式PCR（nested PCR）檢測其原理是通過設(shè)計2對特異引物，第2對特異引物在第1對特異引物的擴(kuò)增序列內(nèi)，利用第1對特異引物（擴(kuò)增較大片段）進(jìn)行20～30個循環(huán)的PCR擴(kuò)增后，其擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板，采用第2對特異引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增，對第2次PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離、染料染色、紫外成像，最后判斷電泳圖像是否含有特異的目的片段。該技術(shù)是基于常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展改良的擴(kuò)增技術(shù)。

半巢式PCR（semi-nested PCR）檢測技術(shù)，其原理與巢式PCR一樣，只是半巢式PCR的第2對特異引物中上游引物或者下游引物是第1對特異引物的引物。

由于食品經(jīng)過加工，尤其是深加工食品（如豆油、大豆磷脂），其DNA受到很大程度的破壞，難以獲得可供利用的有效模板DNA。采用常規(guī)PCR檢測技術(shù)不能完全檢出樣品是否含有植物內(nèi)源基因成分和轉(zhuǎn)基因成分，即使檢出，也很難重復(fù)。與之不同的是巢式PCR和半巢式PCR具有更高的靈敏性、抗干擾能力，能檢測到常規(guī)PCR不能檢測到的水平，而且該方法特異性高，其結(jié)果一般不需要再用其他方法來驗(yàn)證[3]。

1.3 多重PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用 多重PCR（multiplex PCR）檢測技術(shù)是設(shè)計多個基因的特異引物，并且引物間無交叉反應(yīng)，將設(shè)計的多對引物（1對以上）在同一反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)條件，達(dá)到同時針對幾個目的基因進(jìn)行一次性檢測的PCR擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是能同時針對多個基因進(jìn)行一次性檢測，檢測效率高、簡單、準(zhǔn)確等。劉光明等[4]設(shè)計針對CaMV35S啟動子和NOS終止子的特異引物，進(jìn)行多重PCR檢測大豆、馬鈴薯等樣品，結(jié)果與常規(guī)PCR單個擴(kuò)增結(jié)果一致。V.Carcía-Can～as等[5]對5種轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行多重PCR檢測，建立了在一個反應(yīng)體系中同時檢測多種轉(zhuǎn)基因玉米的多重PCR檢測技術(shù)。

1.4 PCR-ELISA檢測技術(shù)的應(yīng)用 PCR-ELISA檢測技術(shù)是PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)的結(jié)合，其原理為設(shè)計對待檢基因的特異引物，同時設(shè)計特異引物擴(kuò)增片段內(nèi)的特異探針，探針的5′端加入地高辛或生物素等標(biāo)記，采用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物與特異的探針相結(jié)合，然后加入抗地高辛或生物素的酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物，進(jìn)行顯色反應(yīng)，判斷結(jié)果是否顯色。PCR-ELISA檢測技術(shù)的主要特點(diǎn)是檢測靈敏度高，相比歐盟推薦的PCR檢測方法，提高了5～10倍。由于該方法的優(yōu)點(diǎn)突出，已廣泛地應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)基因成分的檢測。然而這項(xiàng)技術(shù)操作比較復(fù)雜，時間長，使得該技術(shù)難以大規(guī)模應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物的成分檢測[6]。

2 定量PCR檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用

2.1 競爭性定量PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用 競爭性定量PCR（competitive quantitative PCR，QC-PCR）檢測技術(shù)，其主要原理是首先構(gòu)建與待檢測基因相同動力學(xué)特點(diǎn)和擴(kuò)增效率的DNA，該DNA與待測樣品的DNA混合在同一反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，使它們競爭反應(yīng)體系中的 底物與引物，待PCR擴(kuò)增完成后，對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。同時以不同稀釋梯度的競爭模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算待測基因的含量。研究人員已經(jīng)針對35S啟動子和NOS終止子在Roundup Ready大豆、Bt11、Bt176玉米等轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品上建立了競爭性PCR檢測方法[7]。隨著研究的不斷深入，V.García-Can～as等[8]建立了分析Bt-176轉(zhuǎn)基因玉米的雙重競爭定量PCR（Double QC-PCR，DC-PCR）檢測方法。A.K.Mavropoulou等[9]通過優(yōu)化試驗(yàn)，建立了高通量雙重競爭定量PCR（High-through DC-PCR，HC-PCR）檢測方法，并將該方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分定量檢測分析。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time Quantitative PCR）是應(yīng)用最為廣泛的定量PCR檢測技術(shù)。其基本原理是在PCR擴(kuò)增的初始過程中，模板DNA的拷貝數(shù)的對數(shù)值與ct值之間具有線性關(guān)系。通過設(shè)計分別針對內(nèi)源基因和目的基因的特異的引物和探針，分別在實(shí)時熒光定量PCR上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時采用標(biāo)準(zhǔn)樣品或質(zhì)粒DNA梯度稀釋樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采集各個反應(yīng)的熒光曲線，分別繪制內(nèi)源基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計算待測樣品的內(nèi)源基因和目的基因的拷貝數(shù)，最后計算目的基因的量。目的基因的量=目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)源基因拷貝數(shù)×100%

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)具有簡單、方便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到動植物、微生物、病毒等的定量檢測中，同時也被大量應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測。M.Vaitilingom等[10]建立對食品中Event Bt176玉米和Roundup Ready大豆的轉(zhuǎn)基因成分的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，同時將定量檢測的檢測低限劃分為絕對低限、相對低限和實(shí)際低限。通過建立的Roundup Ready大豆的轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的絕對檢測低限為1個拷貝，而實(shí)際低限為30個拷貝。

2.3 多重實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用 多重實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)是多重擴(kuò)增技術(shù)和實(shí)時熒光定量技術(shù)的整合。常規(guī)實(shí)時熒光定量檢測技術(shù)只對1個目的基因進(jìn)行定量檢測，多重實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)是對多個（1個以上）目的基因進(jìn)行同時檢測。劉光明等[4]通過設(shè)計針對35S啟動子和Nos終止子的雙重特異引物，采用多重實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)對馬鈴薯、甜椒、番茄、玉米、大豆共11份樣品進(jìn)行檢測，其中甜椒1份樣品、大豆1份樣品、馬鈴薯2份樣品和玉米1份樣品同時檢測出35S啟動子和Nos終止子轉(zhuǎn)基因成分，而剩下6份樣品均未檢出轉(zhuǎn)基因成分。

3 基因芯片檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用

基因芯片（Gene Chip）技術(shù)，又稱DNA微陣列（DNA microarray），其基本原理是通過設(shè)計檢測不同目的基因的特異的寡核苷酸探針，探針間高度特異不會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，合成特異的寡核苷酸探針，采用芯片點(diǎn)樣儀將寡核苷酸探針固定在一定面積的基片表面上，制備成基因芯片。對待測樣品的DNA進(jìn)行標(biāo)記，點(diǎn)樣到芯片上與芯片進(jìn)行雜交，雜交、清洗、包埋后的芯片再通過芯片掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描檢測，經(jīng)過統(tǒng)計分析可以計算出樣品含有哪些目的基因。由于芯片能固定大量的針對不同目的基因的寡核苷酸探針，一次檢測可同時分析大量的目的基因，因而具有高通量、高特異性、自動化等優(yōu)點(diǎn)。

基因芯片技術(shù)的發(fā)展迅猛，迅速地被應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因成分的檢測研究中。根據(jù)檢測目的不同可以將轉(zhuǎn)基因成分檢測用的基因芯片分類為普通篩選型芯片、基因特異性檢測芯片、構(gòu)建特異性檢測芯片和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測芯片。J.Xu等[11]設(shè)計了針對20個靶基因的20個寡核苷酸探針，制備成DNA芯片。其中該寡核苷酸探針分為3類：第1類探針是普通篩選型探針，針對CaMV 355啟動子、CaMV 355終止子、nos啟動子、nos終止子、FMV35S啟動子、hpt和Nptll等；第2類探針是物種特異性探針，針對不同物種油菜、大豆、棉花、玉米等物種特異性基因；第3類探針是目的基因特異性探針，如Cp4-EPSPS、Cry1Ab等。該基因芯片雜交后分析結(jié)果與PCR方法和DNA測序進(jìn)行比較，結(jié)果具有很高的一致性，同時該芯片檢測大豆的靈敏度為0.5%、檢測玉米的靈敏度為1%。然而，基因芯片雖然具有高通量特性，但是基因芯片的檢測成本過高，芯片難以標(biāo)準(zhǔn)化（即不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員做出的結(jié)果難以進(jìn)行統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化）。同時，還有很多技術(shù)難點(diǎn)有待進(jìn)一步解決，比如如何簡化樣品制備和標(biāo)記操作程序，如何提高芯片的特異性，消除芯片背景對于結(jié)果分析的影響和增加信號檢測的靈敏度等。

4 未知轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因核酸檢測技術(shù)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全檢測、安全監(jiān)督、風(fēng)險評估提供技術(shù)保障。對于未知的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，其安全風(fēng)險高，可能對人類健康和環(huán)境造成危害，并且PCR方法顯然不能直接檢測，因此建立新的檢測未知轉(zhuǎn)基因技術(shù)相當(dāng)重要，是國際上亟待解決的一大難題。

2005年H.Nesvold等[12]首次對未知轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行研究，他們設(shè)計了一款針對單一物種基因芯片檢測模式。該芯片檢測模式是利用生物學(xué)和組合學(xué)的刪減原則，設(shè)定未知基因芯片探針長度和數(shù)量。T.Tengs等[13]對這一技術(shù)進(jìn)一步探索，他們通過分析常用的235個載體，設(shè)計長度為25個堿基的探針（共37257條），制成高密度的芯片，采用該芯片對擬南芥和水稻進(jìn)行檢測，結(jié)果獲得未知轉(zhuǎn)基因序列及其結(jié)構(gòu)信息。然而該技術(shù)的缺點(diǎn)是對檢測材料的純度要求較高，檢測的結(jié)構(gòu)序列大于140bp并且與已知公認(rèn)的序列相似。然而，P.Akritidis等[14]在商品化的棉花檢測中建立了一種基于事件特異性檢測未知轉(zhuǎn)基因檢測的方法，通過檢測到含有CaMV 35S啟動子，然后采用基因組步移策略擴(kuò)增側(cè)翼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過序列測定，獲得未知轉(zhuǎn)基因的序列，經(jīng)序列比對分析，未知轉(zhuǎn)基因棉起源于Monsanto事件1445轉(zhuǎn)基因棉花。

目前對于未知轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)的研究還處在起始階段，相關(guān)的研究報道還很少，由于基因數(shù)量多，技術(shù)難度高，雖然有一些研究工作者做了探討，但是技術(shù)還不成熟，檢測的范圍不夠廣泛，局限性大。高通量、自動化的基因芯片檢測技術(shù)發(fā)展有可能是未來解決未知轉(zhuǎn)基因檢測的方法。

5 展望

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的數(shù)量連年增長，加上貿(mào)易國際化的加快，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及產(chǎn)品被妖魔化，人們對轉(zhuǎn)基因生物的安全性產(chǎn)生擔(dān)憂，世界各國和地區(qū)均紛紛出臺針對轉(zhuǎn)基因生物安全的管理制度，建立轉(zhuǎn)基因標(biāo)識管理制度，有利于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的標(biāo)識和追溯。因此，開展轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測方法的研究對保障這些法規(guī)實(shí)施極其重要。目前，針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測，主要是使用定性和定量PCR方法。在PCR檢測技術(shù)為主導(dǎo)下的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)，對未知轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的研究仍然是未來發(fā)展的一個重要方面。由于各種檢測技術(shù)的交互使用，研究快速、靈敏、自動化、低成本和高通量的新型檢測方法已經(jīng)成為國內(nèi)外當(dāng)今的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。

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2016-08-30）

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2009ZX08001-023B）

鄧漢超