原花青素影響成骨細(xì)胞中NF-κB及細(xì)胞因子的變化

●孟杰劉剛呂國(guó)平

原花青素影響成骨細(xì)胞中NF-κB及細(xì)胞因子的變化

●孟杰1劉剛2呂國(guó)平1

本研究擬觀察原花青素對(duì)成骨細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響。方法：培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞MC3T3，與原花青素共孵育后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，Trail法提取總mRNA，分別通過(guò)Western blot 和RT-PCR方法，觀察細(xì)胞因子以及NF-κB表達(dá)水平的變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，ELISA結(jié)果提示，原花青素應(yīng)用后，細(xì)胞因子IL-10、IL-6、和IL-13的含量顯著降低（P＜ 0.01），同時(shí)體現(xiàn)劑量依賴性。RT-PCR和免疫蛋白印跡結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，原花青素可以顯著降低MC3T3細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)（P＜ 0.01）。結(jié)論：原花青素可以降低成骨細(xì)胞中細(xì)胞因子及NF-κB的表達(dá)水平。

成骨細(xì)胞；原花青素；NF-κB; IL-6

成骨細(xì)胞是骨代謝的主要功能細(xì)胞，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞對(duì)骨的吸收，決定骨的形成[1]。在骨吸收時(shí)，白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）起到了重要的作用，成骨細(xì)胞可以合成分泌IL-6。細(xì)胞因子如IL-1等能刺激或增加成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，誘導(dǎo)骨吸收和破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成[2-3]。本研究擬以原花青素為研究對(duì)象，通過(guò)培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞MC3T3，利用分子生物學(xué)手段，從蛋白和基因水平觀察成骨細(xì)胞中細(xì)胞因子和NF-κB的變化，探討原花青素影響成骨細(xì)胞生物活性的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

原花青素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度＞98%；NF-κB抗體購(gòu)自sigma公司；成骨樣細(xì)胞MC3T3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞庫(kù)；MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；dNTP和TagDNA聚合酶購(gòu)自Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MC3T3細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板（2×105），MEM培養(yǎng)基（含10%滅活胎牛血清），置37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。分為原花青素處理組（5mol/L，20 mol/L）和對(duì)照組。

1.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的變化

按照上述分組，收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3細(xì)胞上清，ELISA試劑盒(上海凱博)測(cè)定IL-10、IL-6、和IL-13的含量。

1.4 NF-κB蛋白表達(dá)

按照上述分組，收集各組細(xì)胞，加入1ml胞裂解緩沖液，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集上清。Bradford 法蛋白定量，緩沖液稀釋蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入NF-κB抗體孵育（1:1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，再加入二抗（辣根酶標(biāo)記，1：500）, 室溫條件，振蕩1小時(shí)，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，Bio-Rad圖像軟件分析圖像間的差異，計(jì)算灰度值，分析各組間差異。

1.5 NF-κB mRNA表達(dá)

按照上述分組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，Tzail (Invitrogen公司)法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR 分析NF-κB mRNA表達(dá)的變化。NF-κB 基因引物：5'-TCAATGGCTACACAGGAC CA-3'；反義5'-CACTGTCACCTGGAAC-CAGA -3'。β- actin 序列：5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3'；反義5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）合成cDNA模板。反應(yīng)體系為90℃，2min；94℃，2min；60℃，1min；72℃，1min；30cycles；60℃，2min。PCR產(chǎn)物5 ul，加1 ul的loading buffer混勻，加入樣品孔內(nèi)；接通電源，DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)，電壓為5V/cm，1%瓊脂糖凝膠電泳分離30min，終止電泳。0.5%溴化乙錠（EB）染色后，凝膠成像儀觀察圖像，β- actin作內(nèi)參考照，分析各組間mRNA表達(dá)水平的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子水平變化

與空白對(duì)照組相比，原花青素（5mol/L）可以降低細(xì)胞因子的水平（P＜0.05），而原花青素（20mol/L）能夠顯著降低細(xì)胞因子的水平（P＜ 0.01）。

2.2 NF-κB mRNA表達(dá)變化

RT-PCR結(jié)果表明，原花青素（5mol/L）可以降低細(xì)胞中NF-κB mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；經(jīng)20mol/L原花青素處理后，NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。

2.3 NF-κB蛋白表達(dá)變化

Western blot結(jié)果也表明同樣的趨勢(shì), 如圖3所示，原花青素（5mol/L）可以降低細(xì)胞中NF-κB 蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）；經(jīng)20mol/L原花青素處理后，NF-κB 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。

3 討論

原花青素是一類(lèi)天然多酚類(lèi)化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。研究證實(shí)，原花青素可以有效地清除自由基，抑制氧自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而減少I(mǎi)κB的降解，同時(shí)下調(diào)iNOS的表達(dá)，最終可以抑制缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)。原花青素結(jié)構(gòu)中的羥基位點(diǎn)，可與雌激素受體(ER)相結(jié)合，增強(qiáng)甲狀腺釋放激素的作用，從而抑制骨的吸收，促進(jìn)骨的形成[13-14]。

本試驗(yàn)中，通過(guò)不同濃度的原花青素與MC3T3細(xì)胞孵育后，通過(guò)Western blot 和RT-PCR方法，觀察細(xì)胞因子以及NF-κB表達(dá)水平的變化。ELISA結(jié)果提示，原花青素應(yīng)用后，細(xì)胞因子IL-10、IL-6、和IL-13的含量顯著降低，同時(shí)體現(xiàn)劑量依賴性。RT-PCR和免疫蛋白印跡結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，原花青素可以顯著降低MC3T3細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)。提示原花青素可能通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞中NF-κB通路，影響細(xì)胞因子的表達(dá)，改變成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性，發(fā)揮進(jìn)一步的生物效應(yīng)。本研究將為原花青素的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（作者單位：1解放軍理工大學(xué)門(mén)診部；2南京軍區(qū)總醫(yī)院骨科）

[1] Gallagher JC. Advances in bone biology and new treatments for bone loss. Maturitas. 2008,20;60(1):65-9.

[2] Kwan Tat S, Padrines M, Théoleyre S. IL-6, RANKL, TNF-alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15(1):49-60.

[3] Roodman GD. Treatment strategies for bone disease. Bone Marrow Transplant. 2007;40(12):1139-46.

[4] Voehringer D. Basophil modulation by cytokine instruction. Eur J Immunol. 2012;42(10):2544-50.