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    乙型肝炎病毒X區(qū)基因變異與原發(fā)性肝癌的關(guān)系研究

    2016-03-28 05:06:10楊偉李增彩倪秀瑩王濤
    肝臟 2016年1期
    關(guān)鍵詞:原發(fā)性肝癌變異

    楊偉 李增彩 倪秀瑩 王濤

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    乙型肝炎病毒X區(qū)基因變異與原發(fā)性肝癌的關(guān)系研究

    楊偉 李增彩 倪秀瑩 王濤

    【摘要】目的 初步研究乙型肝炎病毒(HBV)X區(qū)基因變異與原發(fā)性肝癌的關(guān)系。方法 收集39例HBV感染患者的肝(癌)石蠟組織標(biāo)本,其中慢性乙型肝炎(CHB)14例、肝細(xì)胞癌(HCC)25例。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增組織中HBVX區(qū)基因,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序,分析常見變異位點(diǎn)的變異情況。結(jié)果 1. HCC組與CHB組相比,在X區(qū)發(fā)生插入/缺失變異,聯(lián)合變異的位點(diǎn)及例數(shù)增多,并且A1762 T與G1764 A常發(fā)生雙突變。2. HBVX區(qū)變異頻率較高位點(diǎn)依次是C1655 T/G、A1605 C/G、A1762 T、G1764 A、A1772B、A1645 C、C1687 A、G1776 T。結(jié)論 HBVX區(qū)存在點(diǎn)突變、插入/缺失變異及聯(lián)合變異,可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

    【關(guān)鍵詞】原發(fā)性肝癌;HBVX基因;變異

    肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是其最重要因素。研究資料證明HBVX區(qū)病毒變異與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本研究對(duì)慢性HBV感染者,其中慢性乙型肝炎(CHB)14例、HCC25例,共39例石蠟組織標(biāo)本的HBVX區(qū)基因變異情況進(jìn)行檢測,以初步探討HBVX區(qū)基因變異與HCC的關(guān)系。

    資料和方法

    一、標(biāo)本來源及分組

    收集39例慢性HBV感染者肝(癌)組織標(biāo)本,其中CHB組肝組織14例、HCC組肝癌組織25例。

    二、主要儀器和試劑

    PCR擴(kuò)增儀:雙螺旋牌PTC-51 DNA溫度循環(huán)器(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)所總后勤部衛(wèi)生部監(jiān)制),PCR擴(kuò)增試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司,DL2000 DNAMarker購自日本Ta KaRa公司。

    三、石蠟組織中HBVDNA提取

    采用傳統(tǒng)的酚-氯仿提取法,提取后置-20℃冰箱保存。除了石蠟組織樣品外,每次提取過程都以1份雙蒸水樣品,作為全程的污染監(jiān)控。所有離心過程都在室溫下進(jìn)行。

    四、引物的設(shè)計(jì)合成及PCR反應(yīng)體系

    從Pub Med GenBank上下載兩條我國常見的B和C基因型的基因序列(ayr基因型,序列號(hào)為X04615和NC-003977),通過查閱文獻(xiàn)資料和應(yīng)用VectorNTISuite8.0軟件對(duì)基因序列多態(tài)性進(jìn)行分析,找出X區(qū)保守區(qū)序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出針對(duì)HBVX基因序列特異的引物,并在blast上比對(duì),最終篩選出如下引物序列。上游引物:5'-TGTGCACTTCGCTTCACCTCT-3',下游引物:5'-AGACCAATTTATGCCTACAGC-3',并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。目的基因位于nt1578-1800,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為223 bp。PCR反應(yīng)體系:在50μL反應(yīng)體系中,加入2×PCRMaster緩沖液25μL(內(nèi)含10 MMTris -HCl、PH8.4的50 MMKCl、1.6 MMMgCl2)、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、模板1.0μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,在94℃變性60 s、51℃退火60 s、72℃延伸60 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72℃終延伸10 min。最后在-20℃冰箱保存。

    五、產(chǎn)物測序及序列分析

    PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接測序,為保證測序結(jié)果的可靠性,測序采用正反雙向測序。測序結(jié)果應(yīng)用BioEdit7.0、Clustal W軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較,同時(shí)在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行比對(duì),測序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

    六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用χ2檢驗(yàn)。

    結(jié) 果

    一、X區(qū)基因擴(kuò)增情況

    PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察(圖1),結(jié)果顯示HCC組20例(20/25)與CHB組5例(5/14),共25例擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)的目的基因長度一致的特異性片段,兩組目的基因擴(kuò)增陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    二、HCC組和CHB組HBVX區(qū)基因點(diǎn)突變情況(見表1)。

    表1 25例標(biāo)本HBVX區(qū)基因變異情況

    對(duì)擴(kuò)增25例標(biāo)本進(jìn)行測序,共發(fā)現(xiàn)71個(gè)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變,前8位變異最多的位點(diǎn)及突變例數(shù)依次為:C1655 T/G(25例)、A1605 C/G(20例)、A1762 T(18例)、G1764 A(14例)、A1772B(12例)、A1645 C(10例)、C1687 A(10例)、G1776 T(10例)。25例均存在C1655 T/G變異,20例合并A1605 C/G變異,18例合并BCP區(qū)熱點(diǎn)雙突變A1762 T/G1764 A。HCC組在突變位點(diǎn)和例數(shù)方面均較CHB組多,且常發(fā)生A1762 T與G1764 A雙突變。

    三、HCC組和CHB組HBVX區(qū)基因插入/缺失變異的情況

    HCC組發(fā)現(xiàn)有18例(18/25)存在插入/缺失變異情況,分別為nt1641-1644缺失1個(gè)C、nt1633-1636間缺失GG、nt1647-1648間插入1個(gè)A、nt1676-1677間插入1個(gè)T、nt1678-1681間缺失AA、nt1731-1735間缺失1個(gè)C、nt1739-1742間缺失1個(gè)A;CHB組僅有2例(2/14)發(fā)現(xiàn)缺失變異,分別為nt1680缺失A、nt1622-1625缺失1個(gè)A。HCC組發(fā)生插入/缺失變異的例數(shù)及變異位點(diǎn)明顯多于CHB組。

    四、HCC組和CHB組聯(lián)合變異的情況

    聯(lián)合變異存在從四聯(lián)到十聯(lián)不同程度的變化情況(見表2)。

    表2 常見變異位點(diǎn)在12例標(biāo)本中聯(lián)合變異的情況

    討 論

    肝癌是最常見惡性腫瘤之一,HBV病毒的慢性感染是肝癌的最重要因素。研究資料證明HBVX區(qū)病毒基因變異與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān),但各項(xiàng)研究尚無統(tǒng)一的觀點(diǎn)和結(jié)果。我們所擴(kuò)增的基因序列位于HBVX區(qū)的nt1587-1800區(qū)段,該區(qū)段包含多個(gè)HBVDNA復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)元件:BCP(ntl742-1849)、CURS(nt1643-1742)、NRE(ntl457-1628)和EnhⅡ(ntl627-1774)[1]。

    在成功測序的25例標(biāo)本(HCC組20例、CHB組5例)中,均存在C1655 T/G變異,另外有20例發(fā)生A1605 C/G變異,推測這兩個(gè)位點(diǎn)變異可能在HBV感染的早期便會(huì)發(fā)生,而與HCC的發(fā)生和發(fā)展無密切關(guān)系。變異例數(shù)前8位位點(diǎn)依次為:C1655 T/G、A1605 C/G、A1762 T、G1764 A、A1772B、A1645 C、C1687 A、G1776 T。BCP區(qū)基因變異A1762 T、G1764 A通常以雙突變的形式存在,是目前的研究熱點(diǎn)。大量研究證明,該雙突變不僅與肝臟炎癥壞死和纖維化有關(guān),還與HCC密切相關(guān)。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)A1762 T/G1764 A雙突變在HCC組與非HCC組有明顯差異[2,3];也有學(xué)者持不同意見,認(rèn)為BCP區(qū)雙突變在HBV慢性感染者中與肝纖維化的進(jìn)展有關(guān),而不是與HCC有關(guān),我們的研究較支持后一觀點(diǎn)。

    既往研究發(fā)現(xiàn)nt1772鄰邊位點(diǎn)常發(fā)生插入/缺失變異[4,5]。本研究25例HCC組發(fā)現(xiàn)有9例存在插入/缺失變異情況,而14例CHB組僅有3例發(fā)現(xiàn)缺失變異。大量的研究資料顯示缺失變異常發(fā)生于羧基端如nt1763-1770、ntl770-1777、ntl753-1772、nt1750-1770等部位的缺失,這些突變能夠降低HBV的復(fù)制水平,與HBs Ag陽性、HBeAg陰性的無癥狀攜帶現(xiàn)象密切相關(guān)[6]。X區(qū)的插入/缺失變異可能與疾病的進(jìn)展有關(guān),Seoung-Ae Lee等發(fā)現(xiàn)缺失/插入變異在肝硬化、HCC比CHB、乙型肝炎病毒攜帶者明顯增高,且均伴隨BCP雙突變[7]。X區(qū)發(fā)生插入/缺失變異后將產(chǎn)生移碼變異,使HBs Ag發(fā)生改變,喪失對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用,導(dǎo)致肝細(xì)胞過度增生發(fā)生癌變。

    HBVX區(qū)基因不但可以在自己區(qū)域內(nèi)發(fā)生聯(lián)合變異,還可以與其他開放讀碼框內(nèi)的位點(diǎn)發(fā)生聯(lián)合變異,本研究中表2也證實(shí)了這點(diǎn)。25例標(biāo)本中的熱點(diǎn)變異位點(diǎn)存在從四聯(lián)到十聯(lián)不同程度的聯(lián)合變異,HCC組在突變例數(shù)及聯(lián)合變異的位點(diǎn)數(shù)目方面均較CHB組多,在所有發(fā)生聯(lián)合變異的標(biāo)本中有7例合并BCP區(qū)熱點(diǎn)雙突變A1762 T/G1764 A。一項(xiàng)Meta分析顯示BCP區(qū)雙突變在HCC患者較非HCC患者明顯增高,若聯(lián)合EnhII/BCP其他變異位點(diǎn)如C1653 T、T1753 V,則這種差異更加顯著,而且是肝癌發(fā)生的早期事件;而C1653 T、T1753 V可能是肝癌發(fā)生的晚期事件[8]。HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,既往研究比較局限于單一位點(diǎn)變異的作用,近年來大家更注重多基因位點(diǎn)、多區(qū)域片段聯(lián)合變異所造成的影響,這也許能更全面地研究和發(fā)現(xiàn)HBV基因變異在HCC中的作用。

    參 考 文 獻(xiàn)

    1 朱榮.慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(biāo)及病毒X基因變異與患者預(yù)后的相關(guān)性研究.上海:復(fù)旦大學(xué),2006.

    2 Shi M,Zhang Y,Zhang J,et al. Hepatitis Bvirus genotypes,precore Mutations and basal core pro Moter Mutations in HBV-infected Chinese patients with persistently normal alanire a minotransferase and low seru MHBVDNAlevels. Braz JInfect Dis,2012,16:52-56.

    3 Asim M,Malik A,Sarma MP,et al. Hepatitis Bvirus BCP,Precore/ core,Xgene Mutations/genotypes and the risk of hepatocellular carcino ma in India.JMed Virol,2010,82:1115-1125.

    4 Moriyama K. Reduced antigen production by hepatitis Bvirus harbouring nucleotide deletions in the overlapping Xgene and precore-core pro Moter.JGen Virol,1997,78:1479-1486.

    5 Cui XJ,Cho YK,Song HJ,et al. Molecular characteristics and functional analysis of full-length hepatitis Bvirus quasispecies fro Ma patient with chronic hepatitis Bvirus infection.Virus Res,2010,150:43-48.

    6 謝佳新,殷建華,何永超,等.乙型肝炎病毒基因變異及其臨床意義.中華疾病控制雜志,2009,13:358-361.

    7 Lee SA,Mun HS,Kim H,et al. Naturally occurring hepatitis Bvirus Xdeletions and insertions a Mong Korean chronic patients.JMed Virol,2011,83:65-70.

    8 Liu S,Zhang H,Gu C,et al. Associations between hepatitis Bvirus Mutations and the risk of hepatocellular carcino ma:a meta-analysis. JNatl Cancer Inst,2009,101:1066-1082.

    (本文編輯:易玲)

    收稿日期:(2015-05-13)

    作者單位:261021 山東省濰坊市第八九醫(yī)院傳染科

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