白首烏C21甾苷對慢性心力衰竭大鼠心肌的保護作用

惠　勇

?

白首烏C21甾苷對慢性心力衰竭大鼠心肌的保護作用

惠勇

【摘要】目的探討白首烏C21甾苷對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌的保護作用。方法采用Wistar大鼠建立CHF模型，隨機分為4組：CHF模型組，給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃；小劑量組，給予白首烏C21甾苷（0.5 g/kg）；中劑量組，給予白首烏C21甾苷（1.0 g/kg）；大劑量組，給予白首烏C21甾苷（2.0 g/kg） ；另設假手術組，給予等體積0.9%氯化鈉注射液。3周后進行血流動力學、心臟指數(shù)、微血管密度（MVD）測量，分別采用Western blot和Real-Time PCR分析檢測基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）蛋白和SDF-1mRNA的表達。結果白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的左心室收縮壓（LVSP）、平均左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）明顯高于CHF模型組，左心室舒張期末壓（LVEDP）明顯低于CHF模型組，左心室松弛時間常數(shù)（Tau）明顯短于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；白首烏C21甾苷劑量組大鼠的SDF-1蛋白及mRNA表達均明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結論白首烏C21甾苷能有效改善CHF大鼠心功能，同時可促進新生血管形成，其機制可能與促進SDF-1表達有關。

【關鍵詞】白首烏C21甾苷；慢性心力衰竭；基質(zhì)細胞衍生因子-1

牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江牡丹江157013

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是一種復雜而常見的嚴重心臟功能障礙性疾病，具有發(fā)病率高、臨床治療困難、預后差和病死率高的特點，嚴重威脅人類的生命健康[1]。世界范圍內(nèi)大約有15 億CHF患者，每年新增病例400萬[2]。目前，CHF 是65歲以上老人住院的主要原因[3]。因此，尋找CHF安全有效的治療方法或藥物顯得尤為重要?，F(xiàn)代研究表明，白首烏中含有磷脂類、C21酯苷、黃酮類化合物、多糖類及微量元素等多種成分，具有明顯的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老等多種藥理作用。白首烏C21甾苷能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基，是白首烏中的主要活性成分[4]，但是其對CHF的影響鮮見報道。本研究就白首烏C21甾苷對CHF大鼠心肌的保護作用進行探討，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級Wistar系大鼠70只，體重200～250 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心，實驗動物合格證號為：P00102012，使用許可證號：SYXK（黑）2012-033。飼養(yǎng)于標準環(huán)境，自由飲食，12 h光照周期。所有實驗操作均遵守《中國動物實用指南》。

1.2提取白首烏C21甾苷采用95%乙醇回流提取白首烏粗粉，減壓回收溶劑得萃取物。萃取物稀釋后使用大孔樹脂（D101）進行層析，水和95%乙醇洗脫、收集95%乙醇部分洗脫液；選用薄層色譜法進行定性分析；采用紫外-分光光度法測定C21甾體總苷含量。經(jīng)分析，C21甾苷的可測成分含量達65%左右（按孕甾烯醇酮計）[5]。

1.3實驗方法

1.3.1心肌梗死后CHF模型的建立及實驗分組給予60只Wistar大鼠腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），麻醉5～10 min后固定于實驗臺上，氣管插管連接呼吸機行機械通氣（呼吸頻率每分鐘70次，潮氣量每次6～7 ml），分離右側頸動脈，經(jīng)頸動脈行左心室置管，記錄大鼠左心功能變化，選用標準Ⅱ?qū)?lián)連接心電圖，并記錄波形。經(jīng)左前胸第3、4肋間開胸，打開心包，擠出大部分心臟，暴露心臟及左心耳[6-7]。于左心耳下方2～3 mm處結扎左冠狀動脈前降支，結扎后心電圖顯示R波振幅明顯升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、avL、avF和V3導聯(lián)ST段弓背向上抬高＞0.2 mV。1周后復查心電圖出現(xiàn)病理性Q波表示心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后，超聲心動圖檢測顯示左心室射血分數(shù)（LVEF）≤45%，說明CHF模型成功建立[8]。術后常規(guī)抗感染治療。共成功建立CHF模型34只，隨機分為4組：CHF模型組（n=8），給予等體積0.9%氯化鈉注射液；白首烏C21甾苷小劑量組（n=8），給予白首烏C21甾苷（0.5 g/kg）；白首烏C21甾苷中劑量組（n=9），給予白首烏C21甾苷（1.0 g/kg）；白首烏C21甾苷大劑量組（n=9），給予白首烏C21甾苷（2.0 g/kg）；另設假手術組（n=10），開胸后在左冠狀動脈前降支下方只穿線不結扎，其余方法與模型建立相同，給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組均為每天1次灌胃，共3周。

1.3.2血流動力學測量用藥3周后采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）測量大鼠血流動力學參數(shù)。大鼠腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉40 mg/kg，麻醉5～10 min后固定于實驗臺，分離右頸總動脈1.5 cm，結扎遠心端，經(jīng)頸動脈插入導管至左心室，通過壓力感受器與軟件相連，5 min后，將導管插入左心室腔。主要參數(shù)包括：心率（HR）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張期末壓（LVEDP）、平均左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）；以Weiss公式計算左心室松弛時間常數(shù)（Tau）。

1.3.3心臟指數(shù)測量檢測血流動力學和超聲心動圖后，稱取大鼠體重（BW），斷頸處死，取出心臟。4℃ 0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干。剪去心房和血管組織，稱取全心質(zhì)量（HW），從心室處沿室間隔剪開，稱取左心室質(zhì)量（LVM），計算心臟指數(shù)：全心質(zhì)量指數(shù)=HW/BW；左心室質(zhì)量指數(shù)=LVW/BW；左心室心重比=LVW/HW。

1.3.4微血管密度（MVD）測量心室肌組織標本4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、HE染色，顯微鏡觀察。首先選擇低倍視野下觀察微血管最為豐富處，以管腔內(nèi)見紅細胞為判斷標準，然后隨機選擇3個高倍視野進行拍照。Image-pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)進行微血管計數(shù)，取其平均值。MVD=血管數(shù)/mm2。

1.3.5Western blot分析心室肌組織標本在蛋白酶抑制劑存在下勻漿，以獲得蛋白提取物，Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。取20 μg蛋白質(zhì)加入等體積2×上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。隨后進行7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后，電轉至0.45 μm硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉PBST（25 mM Tris pH=7.5,150 mM NaCl,0.1% Tween 20）封閉1 h，分別加入抗基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1,SDF-1）抗體（1:2000稀釋）4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5 min。加入HRP標記的2抗（1:2000稀釋）室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min。按同樣的方法與GAPDH抗體孵育。ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過Bio-Rad凝膠成像法檢測SDF-1的表達。蛋白的相對表達強度=目標蛋白表達強度三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）蛋白表達強度。

1.3.6Real-Time PCR分析按照TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA，采用Nanodrop2000檢測RNA純度。使用M-MLV逆轉錄試劑盒（Reverse Transcriptase kit promega,Japan）進行逆轉錄反應成單鏈cDNA，操作按照試劑盒說明書進行。利用Pubmed查找相關基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物，引物序列見表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物進行擴增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀測出ΔC值及熔解曲線，計算出相對基因表達量。每份樣品檢測3次。

表1　Real-Time PCR序列

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1血流動力學結果與假手術組大鼠比較，CHF模型組大鼠的LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax均明顯低于假手術組，LVEDP明顯高于假手術組，Tau明顯長于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而CHF模型組和假手術組大鼠的HR差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax明顯高于CHF模型組，LVEDP明顯低于CHF模型組，Tau明顯短于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2　白首烏C21甾苷對CHF大鼠血流動力學的影響(±s)

表2　白首烏C21甾苷對CHF大鼠血流動力學的影響(±s)

注：與假手術組比較，＊P＜0.05；與CHF模型組比較，＃P＜0.05；與中劑量組比較，$P＜0.05

組別 　例數(shù) HR(次/min) LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg)假手術組 　10 　427±87 　150±41 　2.9±0.7 CHF模型組 　8 　410±85 　121±33＊　9.4±2.1＊小劑量 　8 　424±87 　123±32 　8.9±1.7中劑量 　9 　426±87 　142±36?！?.7±1.5＃大劑量 　9 　420±86 　148±37＃$　3.6±1.1＃$組別 　例數(shù) +LVdP/dtmax(mmHg/s) -LVdP/dtmax(mmHg/s) 　Tau(ms)假手術組 　10 　4717±868 　-4281±531 　5.6±1.7 CHF模型組 　8 　2913±446＊　-2534±381＊17.3±4.2＊小劑量 　8 　3021±579 　-2775±396 　16.3±4.0中劑量 　9 　4056±717?！?3876±503＃10.8±3.4＃大劑量 　9 　4172±726＃$　-4035±521＃$　8.2±2.6＃$

2.2心臟指數(shù)測量結果CHF模型組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW均明顯高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW均明顯低于CHF模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3　白首烏C21甾苷對CHF大鼠心臟指數(shù)的影響(±s)

表3　白首烏C21甾苷對CHF大鼠心臟指數(shù)的影響(±s)

注：與假手術組比較，＊P＜0.05；與CHF模型組比較，＃P＜0.05

組別 　　例數(shù)　HW/BW 　LVW/BW LVW/HW(g/g)假手術組 　10 　0.69±0.19 　0.26±0.071 0.18±0.043 CHF模型組　 8 　0.74±0.20＊0.29±0.078＊0.21±0.058＊小劑量 　 8 0.73±0.20 　0.29±0.072 0.21±0.055中劑量 　 9 　0.71±0.19＃0.27±0.068＃0.18±0.044＃大劑量 　 9 　0.70±0.181＃0.27±0.063＃0.18±0.040＃

2.3MVD測量結果CHF模型組大鼠的MVD明顯低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；白首烏C21甾苷中、大劑量組大鼠的MVD明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4　白首烏C21甾苷對CHF大鼠MVD的影響(±s)

表4　白首烏C21甾苷對CHF大鼠MVD的影響(±s)

注：與假手術組比較，＊P＜0.05；與CHF模型組比較，＃P＜0.05；與中劑量組比較，$P＜0.05

組別 　　例數(shù) 　MVD(血管數(shù)/mm2)假手術組 　10 　0.170±0.042 CHF模型組 　 8 　0.018±0.005＊小劑量 　 8 　0.027±0.006中劑量 　 9 　0.150±0.037＃大劑量 　 9 　0.170±0.040＃$

2.4Western blot結果CHF模型組大鼠的SDF-1蛋白表達略微升高；白首烏C21甾苷劑量組大鼠的SDF-1蛋白表達均明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1　白首烏C21甾苷對CHF大鼠SDF-1蛋白的影響

2.5Real-Time PCR結果CHF模型組大鼠的SDF-1mRNA表達略微升高；白首烏C21甾苷各劑量組大鼠的SDF-1 mRNA表達均明顯高于CHF模型組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2　白首烏C21甾苷對CHF大鼠SDF-1 mRNA的影響

3　討論

CHF是各種心臟疾病的終末階段，此時心臟功能變化主要表現(xiàn)為心臟收縮功能明顯下降，心室舒張功能及心室順應性發(fā)生改變，心臟泵血功能與泵功能儲備均降低，血流動力學指標出現(xiàn)異常，進而使心功能降低[9]。本研究結果表明，白首烏C21甾苷可明顯升高CHF模型組大鼠LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax，降低LVEDP，縮短Tau，說明其可明顯改善CHF大鼠的心功能；心臟指數(shù)測量結果表明，白首烏C21甾苷可明顯降低CHF模型組大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW，說明其可減輕CHF大鼠心肌肥厚。

同時，本研究還證實白首烏C21甾苷可升高MVD，說明其可增加新生血管形成。為了闡明白首烏C21甾苷促進新生血管形成的可能機制，本研究對SDF-1的表達水平進行了分析。SDF-1最初是從鼠骨髓基質(zhì)細胞中分離出來的，廣泛表達于多種組織、器官、系統(tǒng)，主要表達于心臟、腦、肝和腎臟等[10]。在胚胎發(fā)育過程、造血、血管發(fā)生、心臟發(fā)生、白細胞亞群和內(nèi)皮細胞的趨化作用中起重要的生理和病理作用。CHF發(fā)生后，SDF-1在介導干細胞向心臟遷移和受損心臟的修復過程中發(fā)揮重要作用，如將攜帶SDF-1基因的質(zhì)粒輸送至損傷心肌附近，可誘導CD34+細胞遷移，可明顯增強骨髓干細胞向梗死心肌遷移，募集干/祖細胞動員至缺血組織，誘導新生血管形成[11-12]。本研究Western blot結果表明，CHF模型組大鼠較假手術組SDF-1表達水平略升高，其屬于機體對不良刺激的一種應激調(diào)節(jié)反應，當這種應激調(diào)節(jié)不能夠完全對抗外來損傷刺激時，勢必造成進一步損傷。給予白首烏C21甾苷干預后，SDF-1表達水平明顯升高，且與劑量呈正相關，與CHF模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義。進一步采用RT-PCR分析，SDF-1mRNA表達明顯升高，結果與Western blot分析結果相似，說明白首烏C21甾苷可升高SDF-1表達水平，誘導CD34+細胞的遷移，從而促進CHF大鼠新生血管形成。

終上所述，白首烏C21甾苷有效改善CHF大鼠心功能。同時可促進新生血管形成，其機制可能與促進SDF-1表達有關。至于白首烏C21甾苷是否通過其他機制發(fā)揮防治CHF機制，如對CD34+細胞的影響，需進一步探討。

參考文獻

[1] Y1ld1r1m E,Cengiz M,Y1ld1r1m N,et al.The evaluation of the clinical utility of urocortin 1 and adrenomedullin versus proBNP in systolic heart failure[J].Anatol J Cardiol,2014 Dec 25.

[2] Fukuda T,Matsumoto A,Kurano M,et al.Cardiac output response to exercise in chronic cardiac failure patients[J].Int Heart J,2012, 53(5):293-298.

[3] Bos-Touwen I,Schuurmans M,Monninkhof EM,et al.Patient and disease characteristics associated with activation for self-management in patients with diabetes,chronic obstructive pulmonary disease, chronic heart failure and chronic renal disease:a cross-sectional survey study[J].PLoS One,2015 May 7;10(5):e0126400.

[4] 陳美華,吳娟娟,朱玉云,等.白首烏對實驗性小鼠抗氧化及耐缺氧作用的研究[J].中國食物與營養(yǎng),2010,(1):71-73.

[5] 陸佳靜,王曉嵐,姚文杰,等.白首烏C21甾苷對小鼠腦缺血再灌注致學習記憶損傷的保護作用[J].中成藥,2009,31(3):463-465.

[6] 王加佳,夏中元,趙博,等.DJ-1/PTEN通路在糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注期間對心肌損傷的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2013, 23(23):37-40.

[7] 鄒吉麗,尹照萍,張利群,等.大鼠心肌缺血再灌注早期心肌及血清中IL-6、TNF-α的表達[J].中國醫(yī)科大學學報,2013,42(9):830-833. [8] 陳萌萌,李艷芳,彭余波.長效硝酸酯對心力衰竭大鼠心臟血管緊張素Ⅱ受體表達水平的影響[J].心肺血管病雜志,2015,34(1):57-41.

[9] 郭瑤,周靜,卞慧敏,等.川芎嗪衍生物liguzinediol對戊巴比妥鈉致急性心力衰竭大鼠血流動力學的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(6):170-174.

[10] 李佳.基質(zhì)細胞衍生因子-1及其受體與心臟疾病[J].心臟雜志, 2008,20(4):501-503

[11] 張繼紅,覃慧林,賀海波,等.丹參對心衰大鼠心肌保護作用及SIRT1和SDF-1、CXCR4 關系研究[J].中藥藥理與臨床,2014,30(6): 96-101.

[12] Periyasamy-Thandavan S,Herberg S,Arounleut P,et al.Caloric restriction and the adipokine leptin alter the SDF-1 signaling axis in bone marrow and in bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. Mol Cell Endocrinol,2015,15(410):64-72.

The Protective Effect of Baishouwu C21Steroidal Glycosides on Myocardium in Chronic Heart Failure Rats

Hui Yong

【Abstract】ObjectiveTo investigate the study of C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum on the myocardial protective effect and angiogenesis in chronic heart failure(CHF)rat model and discuss its possible mechanism. MethodsCHF Wistar rats models were established and rats were randomly divided into four groups:CHF model group was administered equal volume of normal saline orally;Low-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 0.5 g/kg;Middle-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 1.0 g/kg;High-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 2.0 g/kg;Another sham group was administered equal volume of normal saline orally.after 3 weeks,Hemodynamics,cardiac index and microvessel density(MVD) were measured. Western blot and Real-Time PCR were used to detect the expression of stromal cell derived factor-1(SDF-1)protein and mRNA.ResultsBaishouwu C21steroidal glycosides and high dose group rats left ventricular systolic pressure (LVSP),mean left ventricular pressure maximum rise and decline rate(±dp/dtmax) was significantly higher than that of the CHF model group,left ventricular diastolic end pressure(LVEDP) was significantly lower than that of the CHF model group,left ventricular relaxation time constant(Tau) was significantly shorter than that of CHF model group,and showed dose dependent,the differences were statistically significant (P＜0.05);Baishouwu C21steroidal glycosides dose group rats SDF-1 protein and mRNA expression were significantly higher than those in the CHF model group, and there was a dose dependent,differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionBaishouwu C21steroidal glycosides effectively improve heart function of CHF rats.At the same time,it can promote the formation of new blood vessels.The mechanism may and promote the expression of SDF-1.

【Key words】C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum;Chronic heart failure;Angiogenesis;Stromal cell derived factor-1

作者簡介：惠勇，副主任醫(yī)師，副教授。研究方向：心血管疾病

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.02.003