我國豬細小病毒病的流行現(xiàn)狀及實驗室診斷技術(shù)研究進展

祖立闖，謝金文，王文秀，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

我國豬細小病毒病的流行現(xiàn)狀及實驗室診斷技術(shù)研究進展

祖立闖1，謝金文2，王文秀2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬細小病毒?。≒orcine parvovirus infection,PPI）是由豬細小病毒（Porcine parvovirus,PPV）引起的一種病毒性傳染病，能導(dǎo)致母豬以產(chǎn)木乃伊胎、死胎、弱仔和流產(chǎn)、返情、不孕為主要特征的繁殖障礙，特別是對初產(chǎn)母豬的危害最為嚴(yán)重，目前發(fā)現(xiàn)一些皮炎、腸炎、呼吸道問題的病例也與PPV的感染有關(guān)[1]。我國于1983年首次分離到該病毒，目前呈全國性散發(fā)流行。PPV對環(huán)境的抵抗力很強，豬場一旦感染后不易凈化消除，可能連續(xù)幾年不斷地出現(xiàn)母豬繁殖失敗，且PPV常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等致病原混合感染，使其危害性大幅增加[2]，每年都給養(yǎng)豬業(yè)帶來一定的經(jīng)濟損失。筆者就目前我國PPI的流行現(xiàn)狀及實驗室診斷技術(shù)進行綜述，以期為我國PPI的綜合防控提供參考與借鑒。

1 流行現(xiàn)狀

趙光偉等[3]利用PCR的方法對川渝地區(qū)9個發(fā)病豬場的62份病料進行了檢測，有3個豬場10份病料為陽性，陽性率為16.1%，表明重慶地區(qū)發(fā)病豬群中PPV是一個非常重要的致病原。余波等[4]采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）方法對貴州省未免疫疫苗的176份豬血清進行了抗體檢測，陽性率為14.20%，PPV感染在貴州省豬場中普遍存在。楊尚斌等[5]采用ELISA方法對大理地區(qū)58個散養(yǎng)戶未進行疫苗免疫的243份豬血清進行了檢測，陽性率為85.60%，表明大理地區(qū)散養(yǎng)戶PPI已經(jīng)普遍流行。范磊等[6]應(yīng)用ELISA對淮安市清浦區(qū)沒有免疫疫苗的5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的規(guī)模豬場和散養(yǎng)戶共計133份血清樣品進行抗體檢測，規(guī)模豬場和散養(yǎng)戶陽性檢出率分別是8.99%和9.09%，個別鄉(xiāng)鎮(zhèn)陽性率高達20%，清浦區(qū)大部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)模豬場和散養(yǎng)戶已被PPV污染。李祥峰等[7]采用ELISA方法對楚雄州楚雄市、祿豐縣和南華縣未免疫豬群的276份樣品進行了檢測，陽性率為56.9%，表明該地區(qū)豬群已被PPV感染。呂忠芬等[8]采用ELISA方法對會澤縣未免疫過疫苗的245份豬血清進行了抗體檢測，陽性率為66.12%，表明會澤縣豬群中PPI已經(jīng)普遍流行。曾貴英等[9]采用ELISA方法對遵義市14個縣27個不同規(guī)模豬場未進行疫苗免疫的1 238份豬血清進行了檢測，陽性率為10.82%，其中大、中、小型豬場的陽性率分別為5.38%、11.20%、13.68%，表明遵義市不同規(guī)模豬場豬群中均存在PPV的感染。彭澤琴等[10]采用ELISA方法對臨滄地區(qū)未進行疫苗免疫的25份豬血清進行了檢測，陽性率為32.0%，表明臨滄地區(qū)存在PPV的感染。以上流行病學(xué)調(diào)查資料共同表明，PPI在國內(nèi)豬群中已流行廣泛，且在個別地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴(yán)峻，應(yīng)加強重視。

2 實驗室診斷技術(shù)

PPV常常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體等病原混合感染?；旌细腥炯又亓思膊〉膰?yán)重程度，同時也增加了PPI臨床診斷的難度，故目前對PPV感染的確診主要依靠實驗室診斷技術(shù)。目前，PPV常用的實驗室診斷技術(shù)包括病毒的分離與鑒定、分子生物學(xué)和血清學(xué)診斷技術(shù)。

2.1 病毒的分離與鑒定

病毒分離鑒定方法一直是動物病毒病的經(jīng)典方法，通過易感接種細胞、觀察病變特征等進行診斷，但該方法的試驗周期長，操作較繁瑣，不適合快速診斷。張婉華等[11]將采集的豬木乃伊胎兒內(nèi)臟組織處理后接種ST細胞進行病毒分離，ST細胞產(chǎn)生規(guī)律性病變，表現(xiàn)為細胞圓縮、拉網(wǎng)、灶性脫落等變化，分離毒適應(yīng)于ST細胞培養(yǎng)，并可凝集豚鼠紅細胞，TCID50隨著傳代次數(shù)升高而逐漸增高，分離毒能被PPV特異性陽性血清中和，而不能被PPV陰性血清中和，分離毒對溫度、酸堿不敏感，對乙醚、氯仿等脂溶性溶劑具有較強的抗性，并能抵抗短時間的胰酶處理，接種豚鼠可產(chǎn)生PPV特異性抗體，證實分離毒株為PPV。

2.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

2.2.1 PCR方法 PCR方法是根據(jù)目的基因設(shè)計引物，以病毒基因組DNA為模板，借助DNA聚合酶體外大量擴增目的片段，具有簡便、迅速、特異、靈敏等優(yōu)點，但該方法的敏感性有限，容易漏檢。鄒敏等[12]參考Gen Bank中發(fā)表的PPV VP2基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對引物，經(jīng)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PPV的PCR方法，該方法檢測CSFV、PCV2、PRRSV、PRV均為陰性，使用該方法對215份病料進行了檢測，檢出陽性樣品25份，陽性檢出率為11.63%，可用于PPI的診斷及流行病學(xué)監(jiān)測。

2.2.2 熒光定量PCR方法 熒光定量PCR技術(shù)是融匯PCR技術(shù)和光譜技術(shù)的一種核酸檢測技術(shù)，融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，但該方法對儀器設(shè)備和技術(shù)人員操作水平要求均較高。沈志強等[13]根據(jù)GenBank登錄的PPV VP2基因序列設(shè)計1對特異性引物，經(jīng)PCR擴增出431 bp的目的片段，產(chǎn)物回收與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化到基因工程菌DH5α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR及測序鑒定后，作為標(biāo)準(zhǔn)模板建立了檢測PPV的SYB GreenⅠ熒光定量PCR方法，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，R2=0.997 6，產(chǎn)物Tm在82.3～82.9℃之間，檢測靈敏度為72.1個拷貝/μL，檢測PRRSV、JEV、CSFV、PRV、PCV2均為陰性。實時定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性，為PPV的致病機制研究、臨床早期診斷及定量分析PPV感染程度提供了準(zhǔn)確、敏感的診斷技術(shù)，是一種值得推廣的快速診斷技術(shù)，可用于PPV感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

2.2.3 納米PCR方法 納米PCR是一種新型的PCR技術(shù)，是在PCR緩沖液加入含有粒徑為1～100 nm的納米金屬顆粒，當(dāng)反應(yīng)時納米金屬顆粒懸浮在液體里形成納米流體，這種納米流體相對于普通流體具有更強的導(dǎo)熱性，高導(dǎo)熱性能夠加快溫度升高和下降的速度，使反應(yīng)體系快速達到目標(biāo)溫度，減少在非目標(biāo)溫度的停留時間，增加特異性反應(yīng)時間，從而最終達到消除非特異性擴增，提高擴增效率和敏感性的目的。納米PCR比普通PCR更加敏感，比熒光定量PCR更加方便快捷。崔宇超等[14]針對PPV VP2基因的保守區(qū)域設(shè)計1對擴增472 bp片段的特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件后建立了PPV納米PCR檢測方法，該方法的最低核酸檢出量為4拷貝/μL，敏感性是普通PCR的1 000倍，檢測PCV2、PRV、豬捷申病毒（PTV）、PRRSV、CSFV均為陰性，分別采用納米PCR和普通PCR對3個省份送檢的43份臨床樣品進行了檢測，PPV陽性率分別為95%（41/43）和72%（31/43），表明該納米PCR檢測方法具有更高的敏感性，是一種高效的檢測手段，適用于PPV低含量臨床樣品的檢測，可以應(yīng)用于PPV感染的早期診斷。

2.2.4 LAMP方法 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（LAMP）是2000年以后發(fā)展起來的一種新型核酸擴增新技術(shù)，其依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下擴增核酸，能從僅相差一個核苷酸的基因標(biāo)本中找出相應(yīng)靶序列進行擴增，根據(jù)擴增與否即可判斷目的基因是否存在。LAMP只需在恒溫條件下就能完成擴增反應(yīng)，不需要特殊儀器設(shè)備，并且擴增結(jié)果可通過反應(yīng)體系的濁度或加入染料來直觀判斷，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用，但LAMP方法容易形成氣溶膠污染，造成假陽性的結(jié)果。陳星瑤等[15]根據(jù)PPV VP2基因序列設(shè)計LAMP引物，經(jīng)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PPV的LAMP方法，該方法在恒溫60℃水浴鍋中作用45 min即可完成整個反應(yīng)過程，該方法檢測PCV2、PRRSV、PRV、CSFV、豬水皰病病毒（SVDV）、豬流感病毒（SIV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬鏈球菌均為陰性，該方法的最低檢測量為10拷貝/μL。LAMP方法為PPI的診斷提供了一種快速、便捷且特異性強、敏感性高的檢測方法，可用于PPI的臨床檢測，并具有非常良好的應(yīng)用前景。

2.2.5 液相芯片方法 液相芯片是一種被用于臨床診斷的新型生物芯片，該方法先用PCR將靶基因數(shù)量放大，再與探針雜交，能大大克服單項PCR中的假陽性和假陰性，保證了結(jié)果特異性，是一項突破性的生物芯片分子檢測新技術(shù)，具有高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、靈活性大的特點。王晶鈺等[16]依據(jù)GenBank中PPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因及PCV2全基因序列，設(shè)計PPV和PCV2特異性探針、引物及探針互補序列，將探針與磁性微球偶聯(lián)，對下游引物和探針互補序列標(biāo)記生物素，采用不對稱性二重PCR擴增靶序列，將PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)好的探針進行雜交，用液相芯片儀進行檢測，通過對檢測條件優(yōu)化，建立檢測PPV、PCV2兩種病毒的二重液相芯片方法，該方法對PPV基因拷貝數(shù)檢測下限為1.53×104，該方法與PPV單項PCR檢測結(jié)果符合率為100%，該方法可用于PPV出入境檢疫和獸醫(yī)臨床診斷。

2.3 血清學(xué)診斷技術(shù)

2.3.1 血凝和血凝抑制試驗 豬細小病毒具有血凝性，利用病毒的這一特性可以分別建立檢測病原的血凝試驗（HA）和檢測抗體的血凝抑制試驗（HI）方法。HA和HI方法操作簡便、檢測快速、高通量，是基層獸醫(yī)檢測PPV抗原和抗體較為常用的方法，也是PPV最常規(guī)、最經(jīng)典的診斷方法。但HA和HI結(jié)果判定的主觀性強，難以標(biāo)準(zhǔn)化，而且靈敏度較低、特異性不強，在低滴度感染時難以檢出，因此只能作為輔助診斷方法。張婉華等[17]進一步優(yōu)化了PPV HA、HI微量法試驗，比較了不同紅細胞懸液濃度、不同液體體積、不同形狀微量板對試驗的影響，表明豚鼠紅細胞懸液濃度由原來的0.25%提高到0.50%，用50 μL體積進行HA試驗，用25 μL體積進行HI試驗，在“V”型微量板上的試驗結(jié)果更清晰、更易判斷。

2.3.2 間接ELISA方法 間接ELISA方法主要用于檢測抗體，首先用特異性抗原包被固相載體，加入含待測抗體的樣品，使之與固相抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的第二抗體，使之與待測抗體結(jié)合，再加入底物顯色，顏色的深淺與標(biāo)本中待測抗體的量成正比。我國目前統(tǒng)一使用PPV滅活疫苗，滅活疫苗只能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而不能產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，但自然感染的病毒卻可以同時產(chǎn)生抗結(jié)構(gòu)蛋白抗體與抗非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，故檢測NS1非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體可對滅活疫苗免疫豬和野毒感染豬進行區(qū)分。劉建等[18]分別采用PPV NS1和VP2基因主要抗原區(qū)域經(jīng)原核表達后的NS1和VP2重組蛋白作為包被抗原，分別建立了檢測PPV野毒抗體的NS1-ELISA方法和檢測免疫抗體的VP2-ELISA方法，2種方法檢測PRV、CSFV、PRRSV、PCV2、JEV、FMDV等6種常見豬病病毒的陽性血清均為陰性，檢測靈敏度均為1∶12 800，批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)均小于10%，NS1-ELISA方法與HI的符合率為100%，VP2-ELISA方法與HI的符合率為94.7%。說明所建立的NS1-ELISA和VP2-ELISA方法均具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，這兩種方法的聯(lián)合運用，可實現(xiàn)PPV野毒感染的快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查以及豬群免疫疫苗后的抗體水平監(jiān)測。

2.3.3 雙抗夾心ELISA方法 雙抗夾心ELISA是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。田莉莉等[19]以原核表達的重組VP2蛋白作為免疫原，免疫6周齡BALB/c雌鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，經(jīng)間接ELISA方法篩選，成功獲得了能穩(wěn)定分泌抗PPV VP2蛋白的單克隆抗體，以多克隆抗體和單克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，通過雙抗夾心ELISA各個反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測PPV的雙抗夾心ELISA方法。該方法檢測JEV、PEDV、PRV、PRRSV、CSFV均為陰性，與RT-PCR相比較的符合率、敏感性和特異性分別為93.6%、90.9%、94.4%。雙抗夾心ELISA具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，且具有快速、簡便、經(jīng)濟、安全、高通量等優(yōu)點，可應(yīng)用于PPV感染的早期診斷，為我國PPV感染的診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡便、快速的高通量檢測方法。

2.3.4 IPMA方法 免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）是在感染病毒的多孔細胞培養(yǎng)板中加入待檢標(biāo)本，再加入標(biāo)有辣根過氧化物酶抗免疫球蛋白特異抗體，經(jīng)底物顯色后利用光學(xué)顯微鏡即可觀察結(jié)果。劉杉杉等[20]采用病毒感染細胞后固定作為檢測抗原，建立了檢測PPV血清抗體的IPMA方法，該方法中PPV種毒按照1∶100的劑量接種后48 h固定效果最佳，辣根過氧化物酶-葡萄球菌A蛋白標(biāo)記物的最適稀釋度為1∶1 000，待檢血清最適稀釋度為1∶100。該IPMA方法與PCV2、PRV、PRRSV和CSFV的參考血清無交叉反應(yīng)，PPV陽性血清稀釋至1∶1 600時仍能檢出，該IPMA方法與HI和間接ELISA的符合率分別為96.0%與98.0%，對現(xiàn)地送檢的400份豬血清樣本進行檢測，平均檢出陽性率為86.5%。該IPMA方法試驗過程所需時間短、操作方便、性能穩(wěn)定、易于臨床推廣，并且觀察時只需普通的光學(xué)顯微鏡，適用于基層流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢測和疫苗免疫后血清抗體的監(jiān)測。

3 小結(jié)與展望

現(xiàn)階段的流行病學(xué)調(diào)查表明，PPI在我國豬群中呈全國性、散發(fā)性、區(qū)域性流行，其感染率一直居高不下，感染情況比較嚴(yán)峻，應(yīng)加強重視。對于PPV的各種實驗室檢測方法，病毒分離與鑒定試驗周期長，不利于快速檢測。PCR操作簡單，但敏感性有限，且其擴增產(chǎn)物進行電泳使用的溴化乙錠（EB）對環(huán)境具有一定的污染。LAMP方法對儀器設(shè)備要求較低，但敏感性太高，易產(chǎn)生氣溶膠污染。納米PCR提高了常規(guī)PCR方法的敏感性，但仍然沒有解決EB對環(huán)境的污染問題。熒光定量PCR方法彌補了常規(guī)PCR敏感性有限、不能定量以及EB對環(huán)境的污染問題，但對儀器、試劑、操作人員技術(shù)水平要求均較高，有條件的實驗室可選擇使用。血清學(xué)檢測方法在病毒感染的早期無法檢測到抗體，具有一定的滯后性，但血清學(xué)方法操作簡單、檢測快速、高通量，可以作為大面積流行病學(xué)調(diào)查的初篩以及疫苗免疫后的抗體監(jiān)測。相信隨著研究學(xué)者對PPV研究的不斷深入，以及分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的進一步完善與標(biāo)準(zhǔn)化，PPI的各種實驗室診斷技術(shù)必將會走向不斷成熟與完善，從而逐步提高我國PPI實驗室診斷水平，保障我國PPI防控事業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。

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（編輯：柳青）

忽思慧：節(jié)制飲食 調(diào)和喜怒

忽思慧是元代蒙古族著名醫(yī)學(xué)家，兼通蒙、漢醫(yī)學(xué)。他撰寫了我國第一部營養(yǎng)學(xué)專著《飲膳正要》。他的養(yǎng)生觀簡介如下。

重視飲食 忽思慧指出，要饑前進食，吃得太飽，容易造成過度飽食，易患肥胖癥及其他各種慢性病。要未渴先飲，已渴則體內(nèi)缺水嚴(yán)重，易造成飲水過多，而飲水過多則使心腎受害。要少食多餐，少餐多食損傷胃腸，又易患肥胖癥。

忽思慧認為，早晨一定要吃好早餐；夜晚不可飽食；主張飯后及時漱口。他說：“凡食訖溫水漱口，令人無齒疾、口臭。”又說：“清旦鹽刷牙，平日無齒疾?！边@些論述對于護牙固齒和保持口腔清潔衛(wèi)生來說，至今仍然很有參考價值。飯后或夜晚漱口刷牙，可及時清除牙縫間的食物殘渣，既能保護牙齒，又可防止口臭；漱口水用溫水特別是冬天更要用溫水而不用冷水，這對防止牙齒松動很有好處；可隔三岔五地用鹽水刷牙，對護牙固齒亦有益處。

起居有常 忽思慧說，凡人坐，必要端坐，使正其心；凡人立，必要正立，使直其身。無論做的姿勢或站的姿勢都要端正，這不但關(guān)系到一個人儀表風(fēng)度，也關(guān)系到身心健康。立不可久，久立傷骨；坐不可久，久坐傷肉；行不可久，久行傷筋；臥不可久，久臥傷氣；視不可久，久視傷血。無論站、坐、行走、睡臥、視聽，均要掌握時間，適可而止，不可過久，過久則容易招致各種損傷。凡日光射，勿凝視，損人目。不可凝望烈日，否則強烈的紫外線會灼傷眼睛。夜晚若亮著燈睡臥，腦垂體就難以正常分泌激素，勢必降低睡眠質(zhì)量，影響人體健康。夜晚就寢以前用溫水洗腳，即可溫暖四肢，又可使人安眠。

控制情緒 無論喜怒哀樂，均不可太過。忽思慧說，怒不可暴，怒生氣疾、惡瘡。經(jīng)常暴怒的人既會損傷正氣，又易生癰疽惡瘡。常默，元氣不傷；少思，慧濁內(nèi)光；不怒，百神安暢；不惱，心地清涼。樂不可極，欲不可縱。經(jīng)常少言語而保持清靜，就不會損傷元氣；不過度思考問題，則頭腦清晰，思維敏捷；不憤怒則精神安寧舒暢；不煩惱則心靜自然涼。有可喜可樂之事絕不狂喜狂樂，一切嗜欲都必須有所節(jié)制，切忌任意放縱。倘能這樣做，自然有利于身心健康和延年益壽。

古人自幼重視養(yǎng)生，忽思慧提出，養(yǎng)生保健應(yīng)從娃娃抓起，不論青少年還是中老年人，都應(yīng)當(dāng)高度重視防病健身這一重大問題，絕不可等閑視之。這一觀點對現(xiàn)代人養(yǎng)生保健仍有指導(dǎo)作用。

（摘自《中國中醫(yī)藥報》，2016-10-26 王東升/文）

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)任務(wù)（SDAIT-08-17）；海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室開放課題（HKL201601）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com