芒針促進(jìn)急性脊髓損傷恢復(fù)的機(jī)制研究*

全仁夫，李長(zhǎng)明，，謝尚舉，楊宗保

(1.浙江省蕭山中醫(yī)院，浙江 杭州 310009;2.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102)

芒針促進(jìn)急性脊髓損傷恢復(fù)的機(jī)制研究*

全仁夫1，李長(zhǎng)明1，2，謝尚舉1，楊宗保2

(1.浙江省蕭山中醫(yī)院，浙江 杭州 310009;2.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102)

目的:應(yīng)用改良Allen’s造模法制備大鼠急性脊髓損傷(SCI)模型，觀察芒針(elongated needle)對(duì)大鼠急性脊髓損傷后促炎性因子表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，并探討與NF-κB信號(hào)通路的可能作用機(jī)制。方法:成年雄性SD大鼠36只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、芒針組，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)炎性因子腫瘤環(huán)死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的含量和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)含量的變化，用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，用HE染色觀察脊髓組織細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果:脊髓損傷后7 d，模型組與假手術(shù)組比較受損脊髓組織中NF-κB和促炎性因子含量顯著升高，且TUNEL凋亡率增加，芒針組大鼠受損脊髓組織中NF-κB和促炎性因子含量及TUNEL凋亡率較模型組顯著降低。結(jié)論:芒針可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而降低大鼠急性脊髓損傷后脊髓組織中炎性因子的表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

芒針;脊髓損傷;NF-κB;促炎性因子;凋亡

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由多種不同致病因素引起的脊髓結(jié)構(gòu)和功能的損害，導(dǎo)致?lián)p傷平面以下感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、自主神經(jīng)功能改變，常導(dǎo)致截癱或四肢癱，目前尚無(wú)有效的治療手段?，F(xiàn)在研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)和凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷的主要成分，在急性脊髓損傷的病理生理學(xué)機(jī)制中處于中心地位［1-2］。NF-κB信號(hào)通路是最基本的一條通路，當(dāng)細(xì)胞受到各種胞內(nèi)外刺激后，IκB激酶被激活，從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化、泛素化，然后IκB蛋白被降解，NF-κB二聚體得到釋放。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是炎癥相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起重要作用。芒針治療作為一種傳統(tǒng)中醫(yī)療法，具有疏經(jīng)通絡(luò)、調(diào)節(jié)平衡臟腑氣血作用。脊髓損傷后針刺治療能促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，芒針能明顯促進(jìn)脊髓損傷后新西蘭家兔神經(jīng)誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。但芒針是否可以通過(guò)抑制 NF-κB通路減少炎癥基因表達(dá)和神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)，目前尚不明確。本文建立SD大鼠脊髓急性損傷模型，探討芒針對(duì)急性脊髓損傷后NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，了解芒針對(duì)脊髓損傷后NF-κB的激活，炎癥細(xì)胞因子表達(dá)以及脊髓組織細(xì)胞凋亡的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康成年雄性 SD大鼠36只，體質(zhì)量220 g～250 g，購(gòu)自廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)SYXK(閩)2013-0006)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、芒針組各12只。

1.2 主要儀器與試劑

芒針和華佗牌電針治療儀購(gòu)自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司(型號(hào)SDZ-II);酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)TEK-BIO儀器廠(型號(hào)Cytation3);顯微鏡購(gòu)自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司(型號(hào)BA400);病理石蠟包埋機(jī)購(gòu)自沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司(型號(hào)LS-100);石蠟切片機(jī)購(gòu)自北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司(型號(hào)Finesse 325);TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB試劑盒購(gòu)自美國(guó)TSZ公司;Tunel試劑盒購(gòu)自羅氏生物公司;高效切片石蠟購(gòu)自上海華永石蠟有限公司;蛋白酶K購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 動(dòng)物模型制作

采用改良Allens法制作急性脊髓損傷模型。實(shí)驗(yàn)前禁食 8 h，實(shí)驗(yàn)順序隨機(jī)進(jìn)行，各組動(dòng)物采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)進(jìn)行腹腔注射麻醉。俯臥位固定，無(wú)菌操作取胸背部正中切口，長(zhǎng)約2.5 cm，逐層切開(kāi)皮膚及皮下組織，暴露上下各1個(gè)錐體長(zhǎng)度，咬除T9-T10棘突及全部椎板，暴露0.5 cm寬硬膜。用質(zhì)量為10 g的克氏針沿帶有刻度的導(dǎo)管從60 mm高處垂直自由下落，打擊在直徑4 mm、寬2 mm的由薄塑料材料制成的半圓片上，致傷后迅速移開(kāi)打擊物，造成大鼠脊髓后角中度損傷并逐層縫合。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在(37±0.5)℃的溫度下進(jìn)行，術(shù)后4-0絲線逐層縫合，每天青霉素(80 U/d)腹腔注射預(yù)防感染，分籠飼養(yǎng)保持室溫在20～25℃，給予充足的食物和水。每天3次膀胱按摩協(xié)助排尿，直至建立反射性膀胱排空。模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，打擊后損傷處脊髓出血水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。

1.4 干預(yù)方法

模型對(duì)照組造模成功后不予治療。芒針組造模成功后，待其麻醉蘇醒再進(jìn)行芒針治療。針灸穴位根據(jù)世界衛(wèi)生組織制定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)穴位及前期研究基礎(chǔ)［5］進(jìn)行選擇:①秩邊:臀外下部，股骨大轉(zhuǎn)子與薦椎尾椎結(jié)合部連線外1/3與中1/3交點(diǎn)處;②水道:腹部，恥骨聯(lián)合與胸劍聯(lián)合中點(diǎn)連線(分13等份)恥骨聯(lián)合上3等份旁開(kāi)約2 cm處。針刺部位備皮消毒，不銹鋼針灸針(0.35 mm直徑，華佗牌)針刺至大約2 cm的深度，捻轉(zhuǎn)1 min并留針15 min，并使同側(cè)“秩邊”、“水道”組成一回路連接于 JL2B型電脈沖刺激儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，治療儀參數(shù)為頻率2/100 Hz，電流1 mA，刺激15 min，電針左右隔次交替，每日1次。

1.5 脊髓組織取材

所有大鼠于損傷7 d后取材。腹腔注射水合氯醛(0.3 ml/100 mg)麻醉，經(jīng)主動(dòng)脈先灌注生理鹽水300 ml，再灌注4%多聚甲醛(pH=7.4)200 ml固定組織，取損傷中心節(jié)段組織1cm置于4%多聚甲醛中4℃過(guò)夜。梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切取6um薄片用于ELISA法檢測(cè)。待動(dòng)物麻醉后于冰上迅速剪取損傷區(qū)脊髓組織(以損傷段上下各0.5 cm區(qū)域)，迅速浸入液氮5 min后轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TUNEL原位末端標(biāo)記法

TUNEL法按照TUNEL檢測(cè)試劑盒(羅氏生物公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片二甲苯脫蠟和再水化，Proteinase K工作液處理20 min，PBS洗3次，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上(1號(hào)試劑2號(hào)試劑以1∶14混合)，加蓋玻片或封口膜暗濕盒中37℃1 h。PBS洗1次，滴加50 μL3號(hào)試劑37℃30 min，PBS洗1次，再滴加100 μL新鮮配制的 DAB工作液，顯微鏡下觀察隨時(shí)終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù) TUNEL陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，結(jié)果以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分比表示。

1.7 HE染色

脊髓損傷后7 d，各組大鼠給予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)和過(guò)量肝素生理鹽水心臟灌注20 min，再用0.1 molPBS配置的4%多聚甲醛固定液(pH7.4)灌注5 min，取受損節(jié)段脊髓組織1cm石蠟包埋，切成縱向6um厚的石蠟切片，組織片二甲苯脫蠟，加入1X蘇木素染液/溶性伊紅染液，中性樹(shù)膠封固，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行分析。

1.8 ELISA檢測(cè)

取－80℃保存的脊髓組織于冰上解凍，以每克組織加入3 ml裂解液冰浴超聲勻漿，4℃離心機(jī)靜置20 min，3000 r/min離心20 min，吸上清液500ul，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ√崛〉纳锨逡杭安煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)品各孔 100 ul，根據(jù) TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)處以陰性對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè)結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的濃度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芒針對(duì)脊髓組織形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)組可見(jiàn)，脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，細(xì)胞膜、細(xì)胞核及組織間隙均正常，白質(zhì)纖維分布均勻，髓鞘形態(tài)完整，排列整齊(見(jiàn)圖1A1)。芒針組介于假手術(shù)組和模型組之間，可見(jiàn)脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，組織中散在血細(xì)胞，組織無(wú)水腫;灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，空泡變性減輕，部分細(xì)胞仍存在空泡變性，細(xì)胞核無(wú)明顯固縮，白質(zhì)纖維分布基本均勻，形態(tài)完整、無(wú)脫髓鞘(見(jiàn)圖1C1)。模型組可見(jiàn)，脊髓形態(tài)不完整，神經(jīng)組織殘缺;組織重度出血，存在大量血細(xì)胞;組織疏松水腫、細(xì)胞空泡變性、部分細(xì)胞核固縮、神經(jīng)纖維溶解、消失;灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、核裂解甚至消失，細(xì)胞周圍基質(zhì)消失呈空泡狀;白質(zhì)纖維減少，分布不均勻，脫髓鞘，形態(tài)不完整且相互融合(見(jiàn)圖1B1)。

圖1 3組大鼠術(shù)后7d時(shí)病理表現(xiàn)和凋亡的變化

2.2 芒針對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵因子NF-κB表達(dá)的影響

表1顯示，ELISA結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠脊髓組織中NF-κB僅有低表達(dá)，脊髓損傷后7 d模型組大鼠脊髓組織中 NF-κB表達(dá)水平較假手術(shù)組均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。芒針治療后脊髓組織中NF-κB含量較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 芒針對(duì)炎性因子 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響

表1顯示，假手術(shù)組大鼠脊髓組織中 TNF-α、IL-1β、IL-6僅有低表達(dá)，脊髓損傷后7 d，模型組大鼠脊髓組織中三者表達(dá)水平較假手術(shù)組均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。芒針治療后脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 芒針對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

圖1顯示，芒針治療后脊髓病灶周圍組織TUNEL染色效果，棕黃色的為凋亡細(xì)胞。假手術(shù)組因未損傷脊髓僅有少量凋亡(見(jiàn)圖1A2)。創(chuàng)傷后7 d，大鼠脊髓損傷節(jié)段周圍出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞(見(jiàn)圖1B2)，相反，經(jīng)過(guò)芒針治療后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(見(jiàn)圖1C1)。提示芒針能明顯抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。術(shù)后7 d，模型組大鼠脊髓組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，芒針組大鼠脊髓組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

3 討論

芒針是由古代九針之一的長(zhǎng)針演變而來(lái)，因其針體長(zhǎng)、刺入深，故特別適用于可以深刺的疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的神經(jīng)根炎、多發(fā)性神經(jīng)炎、癱瘓等，具有普通針灸無(wú)法比擬的效果［6-7］。前期發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷后，1 d和3 d時(shí)芒針和普通針灸的治療效果無(wú)明顯差異，7 d時(shí)芒針的治療效果明顯優(yōu)于普通針灸。故本研究以7 d作為觀察點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)芒針治療后脊髓形態(tài)較模型組完整，促進(jìn)了脊髓的修復(fù)過(guò)程。

核因子 kappa B(nuclear factor-kappaB，NF-κB)炎癥信號(hào)通路是多細(xì)胞動(dòng)物中決定細(xì)胞命運(yùn)的一條重要通路。NF-κB信號(hào)通路可通過(guò)降解 IκBs的方式來(lái)活化，其關(guān)鍵因子NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中能通過(guò)調(diào)控多種基因表達(dá)而參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與增殖及炎癥反應(yīng)等過(guò)程［8-9］。脊髓是神經(jīng)傳導(dǎo)的通路，脊髓原發(fā)性損傷后隨之而來(lái)的繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致殘余神經(jīng)通路受損和功能喪失的重要原因［10］。脊髓損傷后的局部創(chuàng)傷、缺血、低氧等一系列因素導(dǎo)致 IKB的磷酸化，引起NF-KB的活化。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后模型組 NF-κB含量與假手術(shù)組明顯增高，促進(jìn)NF-κB的激活，說(shuō)明NF-κB炎癥信號(hào)通路參與脊髓損傷的過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，芒針治療后抑制NF-κB的活化，說(shuō)明NF-κB炎癥信號(hào)通路參與芒針的治療。

La Rosa等［11］認(rèn)為，脊髓損傷后炎癥反應(yīng)是繼發(fā)損傷的主要原因，產(chǎn)生典型的細(xì)胞因子有TNF-α、IL-1β、IL-6等。細(xì)胞因子主要被NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，其活化過(guò)程調(diào)控主要包括兩條途徑，一是經(jīng)細(xì)胞外的正反饋途徑。NF-κB活化后，可增強(qiáng)TNF-α和IL-lβ的基因轉(zhuǎn)錄，使前炎性細(xì)胞因子 TNF-α和IL-lβ產(chǎn)生和釋放增多，TNF-α和 IL-lβ再次激活NF-κB;還可使 IL-6和 IL-8產(chǎn)生和釋放增多，導(dǎo)致最初的炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大［12-13］。薛奇明［14］在研究電針“足三里”穴治療急性胰腺炎的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，電針“足三里”穴可以減輕?；悄懰徕c誘導(dǎo)的SAP大鼠胰腺病理?yè)p傷，其機(jī)制可能與抑制NF-κB的活性、降低血清促炎因子TNF-α、IL-6濃度有關(guān)。但NF-κB信號(hào)通路是否參與芒針的炎癥抑制及細(xì)胞凋亡，目前還不清楚。而王賽［15］發(fā)現(xiàn)，夾脊、督脈電針可以抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎性因子的表達(dá)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷后經(jīng)芒針治療明顯抑制 NF-κB的激活，且TNF-α、IL-1β、IL-6含量和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均明顯降低。王嫻［16］發(fā)現(xiàn)，NF-κB參與氯胺酮誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元凋亡的過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率明顯升高，芒針治療后NF-κB的激活受到抑制，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降低，說(shuō)明芒針治療后NF-κB通路有可能參與神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

表1 各組大鼠NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率(±s)

表1 各組大鼠NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率(±s)

注:與假手術(shù)組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組 別 含量NF-κB TNF-α IL-1βIL-6 凋亡率(AI)假 手 術(shù) 組 538.80±14.04 154.61±4.51 16.95±0.80 76.67±3.40 0.08±0.018模 型 組 812.43±16.33* 210.31±4.12＊＊ 23.55±0.85＊＊ 101.99±3.18＊＊ 0.95±0.025＊＊芒 針 組 623.36± 8.74## 170.26±2.92## 18.56±1.03## 86.36±1.73## 0.69±0.056##

綜上所述，脊髓損傷后能促進(jìn) NF-κB的激活，進(jìn)而釋放大量的促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6，加重脊髓的繼發(fā)性損害，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。而芒針可能通過(guò)抑制NF-κB的激活，從而減少前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及抑制神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)脊髓形態(tài)的恢復(fù)。

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Effect of Elongated Needle Therapy on Acute Spinal Cord Injury and Its Relation Mechanisms

QUAN Ren-fu1，LI Chang-ming1，2，XIE Shang-ju1，YANG Zhong-bao2
(1.Xiaoshan Hospital of traditional Chinese Medicine，Hangzhou 311201，China; 2.Medical College of Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Objective:Spinal cord injury model is created by Allen’s method，and this study is designed to explore the effect of Elongated needle therpy on the expression of proinflammatory and apoptosis in acute spinal cord injury，and to explore the relationship between NF-κB signaling pathways.Method:36 SD rats were divided into 3 groups:sham-operated group，model group and elongated needle group.The expression of TNF-α，IL-1β，IL-6 and NF-κB were detected by ELISA.Apoptosis neuron was marked with terminal deoxynucleotidyl transferase-midiated deoxyuredine triphosphate-biotin nick end labeling(TUNEL)staining.Organizational changes in cell morpholopy were observed by HE.Results:Compared with shamoperated group，the expression of NF-κB and proinflammatory in model group was markedly increased in the injuried spinal cord at 7d after injuried，and there were more TUNEL-positive cells in model group than in sham-operated group.Compared with other two groups，the rats of elongated group are lessly effected by the expression of NF-κB and Proinflammatory，and decreased the number of TUNEL-postive cells.Conclusion:Elongated needle can inhibit the activation of NF-κB signaling pathway，so that to reduce the expression of inflammatory cytokines and incidence of neural apoptosis in rats after ASCI.

Elongated needle;Spinal cord injury;NF-κB;Proinflammatory;Apoptosis.

R245.31+9

:B

:1006-3250(2016)07-0951-04

2016-01-16

浙江省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2008CB067)-芒針對(duì)急性脊髓損傷后膀胱尿動(dòng)力學(xué)及SCEP影響的研究

全仁夫(1966-)，男，浙江杭州人，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥對(duì)脊柱疾病的臨床與研究。