三七化瘀口服液高效液相色譜指紋圖譜的建立

江國華，黃 健，陳淑映

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528200）

三七化瘀口服液高效液相色譜指紋圖譜的建立

江國華，黃 健，陳淑映

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528200）

目的 探討構(gòu)建三七化瘀口服液指紋圖譜的技術(shù)要點及檢測條件，建立能反映該制劑整體特征的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜質(zhì)量評價方法，為提高制劑質(zhì)量穩(wěn)定性和保證臨床用藥的安全有效提供依據(jù)。方法 色譜柱為Shim－pack VP－ODS柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流動相為（A）乙腈－（B）0．05%磷酸水(pH＝5，梯度洗脫)，流速為1 mL／min，檢測波長為203 nm，進樣量為10 L。結(jié)果 10個不同批次樣品的相似度均在0．9～1．0間。結(jié)論 該色譜圖可作為三七化瘀口服液指紋圖譜，用于三七化瘀口服液的質(zhì)量評價。

三七化瘀口服液；指紋圖譜；高效液相色譜法

三七化瘀口服液為我院中醫(yī)骨傷科的優(yōu)良驗方，由三七和延胡索經(jīng)醇提濃縮后調(diào)配分裝而成，具有活血化瘀、消腫止痛、舒筋通經(jīng)、強身健體的功效，經(jīng)多年臨床實踐證明，對跌打損傷、各種血癥、痛癥等癥療效顯著[1－2]。目前，我院制劑中心采用2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB薄層色譜法對三七化瘀口服液的質(zhì)量進行控制，以三七為對照藥材，以三七的活性成分三七皂苷R1和人參皂苷Rg1，Rb1為對照品。質(zhì)量合格標準為：供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點；置紫外光燈下檢視，顯相同顏色的熒光斑點。此質(zhì)量控制方法僅對復方制劑三七化瘀口服液中的主要成分三七進行定性檢測，不能反映制劑的全面質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)[3－4]是中藥材及中成藥質(zhì)量控制的一種新技術(shù)。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫法建立了三七化瘀口服液的HPLC指紋圖譜，可反映該制劑整體特征的質(zhì)量，提供整體質(zhì)量控制依據(jù)，從而提高制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性和保證臨床用藥的安全有效。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC－100PLUS型雙泵高效液相色譜儀(上海五豐科學儀器有限公司)，配有 UV100型紫外檢測器，WS100型色譜工作站；KH300E型超聲清洗機；BP211D型分析天平。

1．2 試藥

甲醇、乙腈(天津四友精細化學品有限公司)均為色譜純；水為新鮮重精餾水；磷酸(南京化學試劑一廠)為分析純。延胡索乙素（批號為110726－201213）、人參皂苷Rg1（批號為110703－201128）、人參皂苷Rb1（批號為110704－201122）均為化學對照品，供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供；樣品為我院制劑中心自制的不同批次三七化瘀口服液，批號依次為11214171，11214172，11214173，11214181，11214182，11214183，11214191，11214192，11214193，11214201。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Shim－pack VP－ODS柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0．05%磷酸水（B），pH＝5，線性梯度洗脫見表 1；流速為 1 mL／min；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。所有組分均在90 min內(nèi)洗脫出柱。

2．2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取4種對照品適量，加甲醇制成每1 mL含延胡索乙素0．05 mg、人參皂苷Rg10．1 mg、人參皂苷Rb10．1 mg的溶液，經(jīng)0．45 μm有機系微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 流動相線性梯度表

供試品溶液：精密量取三七化瘀口服液5 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，經(jīng)真空干燥后，精密加入甲醇25 mL，精密稱定，超聲10 min，放冷，精密稱定，用甲醇補足減失質(zhì)量，濾過，精密量取1 mL續(xù)濾液，加入5 mL定量瓶中，用甲醇定量至5 mL，再經(jīng)0．45 μm有機系微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．3 方法學考察

穩(wěn)定性試驗：取同一樣品溶液（編號1），分別于0，2，4，8，16，24 h時進樣測定，考察相似度的一致性。利用2004年A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進行相似度評價，結(jié)果的相似度均值為0．982，相對保留時間和相對峰面積的 RSD為0．16%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

精密度試驗：取同一樣品溶液（編號1），連續(xù)進樣6次，考察相似度的一致性。利用2004年A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進行相似度評價，結(jié)果的相似度均值為0．994，相對保留時間和相對峰面積的RSD為0．13%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批次樣品（編號1），按供試品溶液的制備方法平行制備6份進樣測定，考察相似度的一致性。利用2004年A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進行相似度評價，結(jié)果的相似度均值為0．996，相對保留時間和相對峰面積的 RSD為0．14% (n＝6)，表明方法重復性良好。

2．4 指紋圖譜測定

將10批樣品分別按2．2項下方法制備供試品溶液，依次進樣，按擬訂色譜條件測定，記錄色圖譜，見圖1。并在相同條件下測定對照品溶液，見圖2。

圖2 對照品溶液HPLC指紋圖譜全圖

2．5 指紋圖譜分析與評價

2．5．1 共有峰標定

根據(jù)10批次供試品結(jié)果，標定共有指紋峰12個，共有峰面積大于總峰面積的90%，其中4，5號峰由于未能達到基線分離，故兩者的峰面積合計為一峰。而3號峰穩(wěn)定，分離度良好，且為最強峰。故以3號峰作參照峰，其余各共有峰的相對保留時間、相對保留峰面積以及標準偏差見表2和表3。

2．5．2 相似度評價

將10批次供試品測定數(shù)據(jù)結(jié)果導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004年A版軟件系統(tǒng)進行譜峰差異性評價和整體相似度評價，并計算其共有模式，見圖3和表4。

表2 “三七化瘀口服液”指紋圖譜共有峰相對保留時間、相對峰面積及差異性比較

表3 三七化瘀口服液10批次樣品各共有峰相對峰面積

圖3 三七化瘀口服液共有模式均值圖（信號放大1倍）

3 討論

中藥制劑質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到臨床用藥的安全性和有效性，中藥制劑質(zhì)量控制是以中醫(yī)藥理論為指導，應用現(xiàn)代儀器分析手段和方法研究分析中藥制劑的質(zhì)量，對于保障臨床用藥安全、合理、有效有重要意義。醫(yī)院制劑具有針對性強、供應及時、方便患者、需求量小等特點，是工業(yè)制劑的有益補充，但由于受到生產(chǎn)工藝、設(shè)備等限制，醫(yī)院制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性往往不及正規(guī)制藥企業(yè)的產(chǎn)品。因此，醫(yī)院制劑中心應加強制劑的質(zhì)量控制，通過制訂科學的質(zhì)量標準來控制制劑質(zhì)量，有利于制劑質(zhì)量穩(wěn)定、保證使用安全，也有利于制劑工藝流程的改進。

本研究中采用HPLC法構(gòu)建三七化瘀口服液的指紋圖譜，專屬性強，重復性好，操作簡便，符合國家規(guī)定[5]的要求，能反映該制劑整體特征的質(zhì)量，可作為三七化瘀口服液質(zhì)量評價的依據(jù)。

[1]鐘廣玲，陳志維．陳渭良骨傷科臨證精要[M]．北京：北京科學技術(shù)出版社，2001：109．

[2]沈楚龍，陳志維．復方三七口服液治療創(chuàng)傷早期86例[J]．新中醫(yī)，2006，38（10）：81．

[3]任 非，智麗敏，付 穎，等．中藥指紋圖譜色譜技術(shù)及其在質(zhì)量控制中的應用與研究[J]．河北醫(yī)藥，2010，32（21）：3 075－3 078．

[4]曹 玲，王志剛，王連芝，等．色譜法在中藥指紋圖譜研究中的應用 [J]．中國當代醫(yī)藥，2012，19（1）：16－17．

[5]國家藥品監(jiān)督管理局．關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的通知[J]．中成藥，2000，22（10）：671．

HPLC Fingerprints of Sanqi Huayu Oral Liquid

Jiang Guohua,Huang Jian，Chen Shuying
（Foshan Traditional Chinese Medicine Hospital，F(xiàn)oshan，Guangdong，China 528200）

Objective To investigate the fingerprinting techniques and detection conditions of Sanqi Huayu Oral Liquid，build an HPLC fingerprint quality evaluation method to reflect the overall characteristics of the preparation in order to improve the quality of preparation and stability，and provide basis for the safety and effectiveness of clinical medication．M ethods The chromatographic column was Shim－packVP－ODS column（250 mm×4．6 mm，5 μm）；mobile phase was（A）acetonitrile－（B）0．05% phosphoric acid water（pH＝5，gradient elution），the flow rate was 1 mL／min，the detection wavelength was 203 nm；the injection volume was 10 μL．Results By calculating the similarity，the similarity of the 10 batches of samples were between 0．9－1．0．Conclusion The chromatographic diagram can be used as the fingerprint of Sanqi Huayu Oral Liquid，and to evaluate its quality．

Sanqi Huayu Oral Liquid；fingerprint；HPLC

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)08－0069－04

江國華，男，大學本科，主管中藥師，研究方向為醫(yī)院制劑工藝及質(zhì)量控制，（電子信箱）1966325251＠qq．com。

表4 建有共有模式的10批次三七化瘀口服液的均值相似度數(shù)據(jù)表

S10 0．978 0．974 0．972 0．974 0．863 0．868 0．898 0．978 0．869 1．000 0．973樣品編號S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10對照指紋圖譜S1 1．000 0．996 0．990 0．995 0．857 0．863 0．837 0．997 0．864 0．978 0．975 S2 0．996 1．000 0．994 0．999 0．861 0．862 0．837 0．993 0．865 0．974 0．975 S3 0．99 0．994 1．000 0．996 0．868 0．864 0．841 0．993 0．866 0．972 0．976 S4 0．995 0．999 0．996 1．000 0．862 0．863 0．839 0．995 0．865 0．974 0．976 S5 0．857 0．861 0．868 0．862 1．000 0．989 0．894 0．862 0．991 0．863 0．945 S6 0．863 0．862 0．864 0．863 0．989 1．000 0．898 0．865 0．991 0．868 0．947 S7 0．837 0．837 0．841 0．839 0．894 0．898 1．000 0．841 0．898 0．898 0．912 S8 0．997 0．993 0．993 0．995 0．862 0．865 0．841 1．000 0．865 0．978 0．976 S9 0．864 0．865 0．866 0．865 0．991 0．991 0．898 0．865 1．000 0．869 0．948對照指紋圖譜0．975 0．975 0．976 0．976 0．945 0．947 0．912 0．976 0．948 0．973 1．000

2015－10－14)

廣東省佛山市衛(wèi)生局醫(yī)學科研項目，項目編號：2014135。