中藥活性成分復(fù)方對(duì)AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬Aβ的影響*

賀小平，董賢慧（.中國(guó)人民解放軍第266醫(yī)院，河北承德　067000；2.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室）

中藥活性成分復(fù)方對(duì)AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬Aβ的影響*

賀小平1，董賢慧2△
（1.中國(guó)人民解放軍第266醫(yī)院，河北承德067000；2.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室）

目的:觀察淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型海馬β淀粉樣蛋白（Aβ）表達(dá)的影響。方法：6月齡雄性APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基小鼠20只，隨機(jī)分為模型組和復(fù)方組，6月齡雄性C57BL/6J小鼠10只作為正常對(duì)照組。用藥三個(gè)月后，采用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠海馬Aβ的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，模型組Aβ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，復(fù)方組Aβ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：應(yīng)用淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以降低AD模型小鼠海馬Aβ的表達(dá)，從而緩解AD中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退。

阿爾茨海默?。灰蜣?；黃芪；葛根；β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是臨床上常見的一種老年性癡呆綜合癥，病理特征主要是神經(jīng)元間β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成老年斑[1]。中醫(yī)認(rèn)為AD發(fā)病是以腎虛精虧、氣血不足為本，痰瘀互結(jié)、濁毒內(nèi)生為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。根據(jù)中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的治療原則，治療AD應(yīng)補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其標(biāo)[2]。為此，本課題組將淫羊藿、黃芪、葛根活性成分進(jìn)行組方，探討該復(fù)方對(duì)AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型海馬組織Aβ的影響，旨在探討中藥防治AD的療效機(jī)理，為研制治療AD新的方藥提供新思路，為臨床推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組SPF級(jí)6月齡雄性APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠20只，隨機(jī)分為模型組和復(fù)方組，每組10只小鼠。6月齡C57BL/6J小鼠10只作為正常對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)復(fù)方組小鼠灌胃給予淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分復(fù)方，以臨床3倍用藥量給藥，淫羊藿苷120mg/kg、黃芪甲苷80mg/kg、葛根素80mg/kg體重給予小鼠灌胃，各組小鼠用藥處理1次/d，連續(xù)給藥3個(gè)月。模型組和正常對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，時(shí)間同復(fù)方組小鼠。

1.3取材小鼠用藥結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定后斷頭取腦，4%多聚甲醛后固定24h，30%蔗糖溶液沉淀腦組織。完整腦組織使用冷凍切片機(jī)-25℃、20μm連續(xù)切片，-20℃冰箱保存。

1.4免疫組化法檢測(cè)小鼠海馬組織Aβ的表達(dá)每組10只小鼠，每只小鼠選取一張海馬完整的冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，46℃烤片2h，PBS洗3次，每次5min；體積分?jǐn)?shù)3%的過氧化氫處理，山羊血清封閉；兔抗小鼠Aβ（1:500）4℃孵育過夜，山羊抗兔生物素化二抗37℃孵育15min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育15min，DAB顯色，光鏡觀察。每張切片選取3個(gè)視野（×400），顯微成像系統(tǒng)拍照后，用Image-Pro Plus軟件檢測(cè)陽(yáng)性產(chǎn)物的平均光密度值。

2　結(jié)果

正常對(duì)照組、模型組、復(fù)方組海馬Aβ的表達(dá)（平均光密度值）分別為0.403±0.102、0.782±0.096、0.531±0.132。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬Aβ的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，復(fù)方組小鼠海馬Aβ的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

3　討論

AD是常見的老年人慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前其病因、發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，很大程度上制約了AD治療藥物的篩選。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止2005年全球有2430萬人患癡呆，每年新增癡呆病例460萬。這將對(duì)家庭以及社會(huì)造成越來越沉重的負(fù)擔(dān)，因此，對(duì)AD的致病機(jī)理及預(yù)防治療策略的研究顯得尤其迫切。

AD的一項(xiàng)重要病理特征是腦內(nèi)存在大量老年斑(SP)，SP的主要成分是含39-42個(gè)氨基酸殘基的Aβ，是由Aβ前體蛋白APP降解所產(chǎn)生[3]。Aβ在腦內(nèi)位于細(xì)胞外，主要以Aβ40和Aβ42兩種形式存在，其中Aβ42雖含量低，但易于聚集為原纖維而沉積，從而形成彌漫性SP[4]。

在正常生理狀態(tài)下，Aβ在大腦僅有極少量表達(dá)，低濃度的Aβ對(duì)未分化、不成熟的神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)作用，但Aβ的正常生理作用還有待更深入的研究。在神經(jīng)退行性AD大腦中Aβ異常表達(dá)，高濃度的Aβ對(duì)已分化的、成熟的神經(jīng)元有毒性作用，其神經(jīng)毒性涉及到復(fù)雜的分子機(jī)制。高濃度的Aβ同時(shí)會(huì)加速Aβ的生成，以致更多的Aβ沉積和擴(kuò)大大腦炎癥，甚至可能會(huì)使前腦基底部的膽堿能神經(jīng)退化[5]。此外，Aβ自我積聚形成的各種寡聚體，也具有神經(jīng)毒作用，可致正常突觸功能受損。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，輕、中度AD患者在服用黃芪、淫羊藿、葛根等中藥組成的益氣養(yǎng)陰合劑3個(gè)月后，可改善和增強(qiáng)AD患者的智力[6]。以淫羊藿為君藥的益智健腦顆粒也可有效提高AD患者的智力和記憶力，改善AD患者認(rèn)知功能和日常生活自理能力[7]；以黃芪為君藥的益智醒腦湯配合針灸治療老年癡呆癥也具有一定療效；單獨(dú)應(yīng)用葛根的活性成分之一葛根素對(duì)AD患者也具有一定的臨床治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方的小鼠，海馬Aβ的表達(dá)明顯低于AD模型小鼠，說明淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可有效緩解AD模型小鼠因Aβ沉積所造成的神經(jīng)系統(tǒng)功能損害。

中藥具有辨證施治的特性和取材方便、毒性較小的優(yōu)點(diǎn)，但由于中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不夠明確、作用機(jī)制尚不十分清楚、藥物制劑質(zhì)量可控性差等缺點(diǎn)，至今難以走入國(guó)際市場(chǎng)。鑒于此，在明確中藥療效和藥理作用的基礎(chǔ)上，從中藥中分離藥效物質(zhì)清楚的活性成分和藥效物質(zhì)基本清楚并體現(xiàn)中藥整合作用特點(diǎn)的成分配伍，可能為AD的治療帶來新的希望[8]。

本課題組將淫羊藿、黃芪、葛根活性成分進(jìn)行組方，三藥合用，可共起滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)脾養(yǎng)血，活血化瘀、清熱解毒、健腦益智之功。中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)瑰寶，有著上千年的歷史，但是傳統(tǒng)中藥成分復(fù)雜，藥效不穩(wěn)定，且質(zhì)量難以控制[9]。本研究采用中藥的有效成分進(jìn)行組方，既克服了傳統(tǒng)中藥方劑成分復(fù)雜、藥效不穩(wěn)定、質(zhì)量難以控制的缺點(diǎn)，又繼承了傳統(tǒng)中藥方劑多成分、多靶點(diǎn)、多效性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)防治AD有著良好的市場(chǎng)前景。

[1]Zhang J, Zhen YF, Pu-Βu-Ci-Ren, et al. Salidroside attenuates beta amyloid-induced cognitive deficits via modulating oxidative stress and inflammatory mediators in rat hippocampus[J]. Βehav Βrain Res, 2013, 244(1)∶ 70-81.

[2]趙永辰，秦微，陳淑霞，等.老年輕度認(rèn)知功能障礙的中醫(yī)研究現(xiàn)狀[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29(11)：3496-3498.

[3]Prakash A, Medhi Β, Chopra K. Granulocyte colony stimulating factor (GCSF) improves memory and neurobehavior in an amyloidβ induced experimental model of Alzheimer’s disease[J]. Pharmacol Βiochem Βehav, 2013, 110∶ 46-57.

[4]Galante D, Corsaro A, Florio T, et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids[J]. Int J Βiochem Cell Βiol, 2012, 44(11)∶2085-2093.

[5]Suo WZ, Li L. Dysfunction of G protein-coupled receptor kinases in Alzheimer’s disease[J]. Scientific World Journal,2010,10∶1667-1678.

[6]李立新，孫麗萍，尉繼偉，等.益氣養(yǎng)陰合劑加減辨證治療老年性癡呆[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(16)：93-94.

[7]Delacourte A, Sergeant N, Champain D, et al. Nonoverlapping but synergetic tau and amyloid precursor protein pathologies in sporadic Alzheimer’s disease[J]. Neurology, 2002, 59(3)∶ 398-407.

[8]Lue LF, Kuo YM, Roher AE, et al. Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer’s disease[J]. Am J Pathol, 1999,155(3)∶853-862.

[9]楊鳴華，劉祎，孔令義.基于中藥有效單體成分的新藥研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18(3)：329-336

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)

EFFECTS OF EFFECTIVE FRACTION OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE ON AΒ EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS OF TRANSGENIC MOUSE MODEL OF ALZHEIMER’S DISEASE

HE Xiao-ping, DONG Xian-hui
(The 266 Hospital of Chinese PLA, Hebei Chengde 067000, China)

Objective∶ To observe the effects of effective fraction of Epimedium, Astragalus, Radix Puerariae on Aβ expression in hippocampus of APP/PS1 double transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Methods: 20 male APPswe/ PS1ΔE9double transgenic mice aged 6 months were equally and randomly assigned to model and compound group. An additional 10 6-month-old C57ΒL/6J mice served as normal control group. Immunohistochemical stain was used to detect the Aβ expression in hippocampus of mice in each group 3 months after medication. Results: Compared with normal control group, the Aβ expression in hippocampus of mice in model group increased obviously (P＜0.05). Compared with model group, theAβ expression in hippocampus of mice in compound group declined obviously (P＜0.05). Conclusions: The effective fraction of Epimedium, Astragalus, Radix Puerariae can down regulate Aβ expression in hippocampus of Alzheimer’s disease mice model, so to improve impairment of central nervous system of Alzheimer’s disease.

Alzheimer’s disease; Epimedium; Astragalus; Radix Puerariae; Aβ

R285

A

1004-6879（2016）06-0455-03

* 承德市科技局資助項(xiàng)目（201601A022），河北省重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助

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（2016-05-11）