加味天雄散對(duì)弱精子癥患者精子P38MAPK/ERK信號(hào)通路的影響*

耿 強(qiáng)，郭 軍，王 福，韓 強(qiáng)，高慶和，趙 玉，李 重，余國(guó)今，歐陽(yáng)斌

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科，天津 300193;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科，北京 100091; 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院男科，北京 100010)

加味天雄散對(duì)弱精子癥患者精子P38MAPK/ERK信號(hào)通路的影響*

耿 強(qiáng)1，郭 軍2，王 福2，韓 強(qiáng)3，高慶和2，趙 玉1，李 重1，余國(guó)今2，歐陽(yáng)斌1

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科，天津 300193;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科，北京 100091; 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院男科，北京 100010)

研究加味天雄散對(duì)弱精子癥患者精液p38MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。方法:臨床選取弱精子癥患者分為正常組、弱精組、補(bǔ)腎組、健脾組、全方組，分別對(duì)補(bǔ)腎、健脾、全方組給予3個(gè)月的治療，治療后觀察3組患者的精液常規(guī)指標(biāo)，并測(cè)定5組ERK、P38磷酸化和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:各組與治療前比較，A級(jí)精子和A+B級(jí)精子百分率均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組、補(bǔ)腎組、健脾組治療后比較，全方組A級(jí)精子和A+B級(jí)精子百分率改善更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常組比較，弱精組患者精子ERK蛋白表達(dá)明顯升高，全方組ERK蛋白表達(dá)較補(bǔ)腎組降低更為明顯;與正常組比較，弱精組患者精子P38表達(dá)及PP38明顯升高，全方組P38表達(dá)及PP38較補(bǔ)腎組降低更為明顯。結(jié)論:補(bǔ)腎健脾治法可以改善弱精子癥患者精子活力，可能與抑制p38MAPK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

加味天雄散;弱精子癥;p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路

隨著社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力的增大和環(huán)境污染的日趨嚴(yán)重，男性生殖能力呈下降趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織研究發(fā)現(xiàn)，大約有15%的婚后夫婦存在不能正常生育的問(wèn)題［1］，弱精子癥已成為影響男性生育能力的最常見(jiàn)原因［2］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，ROS(活性氧)產(chǎn)生過(guò)多可能是造成男性不育癥的重要病因之一［3］，而ROS是MAPK信號(hào)通路強(qiáng)有力的激活劑，在MAPK傳導(dǎo)通路的一些組成成分，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、P38MAPK信號(hào)通路和精子活動(dòng)力密切相關(guān)。我們?cè)诩韧呐R床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎健脾類中藥能夠起到抗氧化損傷、提高精子活力的作用。本研究觀察加味天雄散對(duì)弱精子癥患者精子的P38MAPK/ERK通路表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 病例選擇

選取2014年6月至2015年3月就診于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科門診的患者，診斷參照《WHO人類精液及精子－宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》(第4版)規(guī)范，正常禁欲間隔時(shí)間內(nèi)測(cè)試2次精液，如果精液量大于3 ml，精子密度超過(guò)20×106/ml，A級(jí)少于25%或者A+B級(jí)少于50%即可診斷為弱精子癥(注:精子活動(dòng)力分級(jí)精子運(yùn)動(dòng)級(jí)別:A級(jí):快速前向運(yùn)動(dòng)精子;B級(jí):慢或呆滯的前向運(yùn)動(dòng)精子;C級(jí):非向前運(yùn)動(dòng)精子;D級(jí):不動(dòng)精子)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合《人類精液及精子－宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》(第4版)標(biāo)準(zhǔn);男性年齡24～45周歲，病程1～4年;近1年內(nèi)夫妻感情穩(wěn)定，有正常的性生活。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

年齡＜25周歲或＞45周歲;妻子伴發(fā)嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)疾病;男方伴發(fā)性功能障礙，如陽(yáng)痿、早泄、性欲低下等;男方服用放化療藥物影響生殖能力者;男方合并梗阻性泌尿系統(tǒng)疾病、三度靜脈曲張;并發(fā)嚴(yán)重的心腦血管病等原發(fā)性疾病;嚴(yán)重的精神疾患;不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或病例記錄不全等影響療效者。

1.4 分組

將弱精子癥患者分為加味天雄散全方組、補(bǔ)腎組、健脾組、弱精癥組4組各30例，并設(shè)精液檢查正常者30例。弱精癥組診斷為弱精癥者，無(wú)生育要求，并不接受藥物干預(yù)治療者，而全方組、補(bǔ)腎組、健脾組3組接受治療。

1.5 治療手段

加味天雄散組成:附子(先煎)6 g，丹參10 g，刺五加10 g，肉蓯蓉10 g，枸杞子20 g，菟絲子15 g，黃芪10 g，白術(shù)15 g，制首烏15 g，桂枝10 g，茯苓15 g，龍骨10 g(先煎);補(bǔ)腎組組成:附子6 g(先煎)，丹參10 g，刺五加10 g，肉蓯蓉10 g，枸杞子20 g，菟絲子15 g，制首烏15 g，桂枝10 g，龍骨10 g(先煎);健脾組組成:附子6 g(先煎)，丹參10 g，刺五加10g，黃芪10 g，白術(shù)15 g，桂枝10 g，茯苓15 g，龍骨10 g(先煎)。

1.6 療程及服藥方法

中藥飲片采用代煎，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，每劑中藥一次性煎至300 ml，分成2袋小包裝，每袋各150 ml，每天2次飯后口服，每次150 ml，加味天雄散全方組、補(bǔ)腎組、健脾組進(jìn)行治療，3個(gè)月為1個(gè)療程，共治療1個(gè)療程。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 精液常規(guī)分析 患者在檢驗(yàn)前禁欲2～7 d，化驗(yàn)前注意休息，避免刺激食物，在天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科取精室完成取精后立即送實(shí)驗(yàn)室恒溫箱。精液分析采用北京中科恒業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的精液分析儀進(jìn)行分析，由專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員完成。

1.7.2 P38MAPK和ERK蛋白表達(dá)、磷酸化水平變化 ①蛋白提取:將－196℃液氮中保存的精子取出，迅速置于37℃水浴鍋內(nèi)解凍，4℃預(yù)冷的PBS(0.1 mol/L pH7.4)洗滌3～4次，轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器中，向研磨器中加入細(xì)胞裂解液，冰浴研磨裂解10 min，移入準(zhǔn)備好的1.5 ml離心管中超速離心4℃、12000 r/min，時(shí)間為15 min。將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的1.5 mlEp管中，測(cè)定上清液總蛋白濃度后調(diào)整蛋白濃度，將上述上清液與計(jì)算后所需要的loading buffer混合，水浴鍋煮沸10 min。②Western印跡檢測(cè):一抗ERK、PERK、P38、PP38抗體購(gòu)自abcam公司，二抗均購(gòu)自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。操作方法:首先制備 SDSPAGE凝膠，然后10%SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜，一抗過(guò)夜后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行孵育、檢測(cè)。

將上述膜室溫封閉2 h，PBST液漂洗3次，每次 10 min，分別加入 ERK、P38MAPK、PERK、PP38MAPK抗體(1∶800)4℃孵育過(guò)夜。次日以PBST漂洗3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1000)二抗孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。洗去硝酸纖維素膜上結(jié)合的一抗、二抗，室溫下以封閉液繼續(xù)封閉2 h。內(nèi)參選用 β-actin抗體(1∶1000)作為一抗，重復(fù)Western blot實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用Quantity One軟件掃描條帶灰度值。各組中ERK、PERK、P38MAPK、PP38MAPK的表達(dá)水平分別用目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比較，ERK、P38MAPK活性分別采用PERK與ERK、PP38MAPK與P38MAPK條帶灰度值之比表示，并使用內(nèi)參蛋白進(jìn)行校正。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，一般計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

本次研究中對(duì)照組3例、補(bǔ)腎組2例患者失訪，健脾組2例、全方組1例患者因工作調(diào)動(dòng)主動(dòng)退出本研究，其余患者完成本次研究。其中全方組患者年齡(28.8±3.8)歲，病程(2.9±2.3)年;補(bǔ)腎組患者年齡(28.1±3.9)歲，病程(2.8±2.9)年;健脾組患者年齡(29.1±3.8)歲，病程(3.1±2.3)年;弱精癥組患者年齡(28.2±4.1)歲，病程(2.9±2.2)年;正常組年齡(28.9±3.4)歲，5組研究病例年齡、病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.1 治療后加味天雄散及其拆方對(duì)弱精子癥患者精子活力的變化

表1可見(jiàn)，補(bǔ)腎組、健脾組、全方組與治療前比較，精子活力百分率均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與對(duì)照組補(bǔ)腎組、健脾組治療后比較，全方組A級(jí)精子和A+B級(jí)精子百分率改善更明顯(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組治療前后精子活力比較(±s)

表1 各組治療前后精子活力比較(±s)

注:與同一組治療前比較:*P ＜0.01;與對(duì)照組治療后比較:#P＜0.01;與健脾組治療后比較:△P＜0.01;與補(bǔ)腎組治療后比較:$P＜0.05

組 別 例數(shù) 時(shí) 間 A級(jí)精子(%) A+B級(jí)精子(%)補(bǔ)腎組 28 治療前13.24±4.98 28.10± 8.45治療后 20.35±7.43* 47.72±12.64*健脾組 28 治療前 14.12±5.215 28.31± 8.14治療后 19.96±8.67* 46.67±12.19*全方組 29 治療前 14.78±4.13 27.31± 8.34治療后 27.26±8.91*#△$ 58.44±13.12*#△$

3.2 加味天雄散治療后患者精子ERK和P38磷酸化和蛋白表達(dá)水平的變化

圖1 加味天雄散對(duì)弱精子癥患者M(jìn)APK信號(hào)通路p38的影響

表2圖1、2可見(jiàn)，與正常組比較，弱精組患者精子ERK蛋白表達(dá)明顯升高;與弱精組比較，藥物干預(yù)組中，補(bǔ)腎組和全方組精子ERK蛋白顯著降低，健脾組無(wú)明顯改變，全方組ERK蛋白表達(dá)較補(bǔ)腎組降低更為明顯;與正常組比較，弱精組患者精子P38表達(dá)及PP38明顯升高;與弱精組比較，藥物干預(yù)組中，補(bǔ)腎組和全方組精子ERK蛋白顯著降低，健脾組無(wú)明顯改變，全方組P38表達(dá)及PP38較補(bǔ)腎組降低更為明顯。

4 討論

隨著環(huán)境污染的日益加重和生活壓力的增大，男性不育癥已成為困擾患者和醫(yī)生的重要問(wèn)題，引起人們的廣泛關(guān)注，男性不育的發(fā)生與精子活動(dòng)力低下有著直接的關(guān)系［4］。引起精子活力低下的病因較多，如生殖道炎癥、精液不液化、精索靜脈曲張、內(nèi)分泌飲食、藥物性飲食等，還有約20% ～40%的患者尚未發(fā)現(xiàn)明確的病因，稱之為特發(fā)性，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并未確切的藥物進(jìn)行治療［5］。隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，ROS對(duì)男性生殖能力的影響目前已被廣為關(guān)注，精液中的超氧化物歧化酶可以清除過(guò)多的活性氧，否則精子活力會(huì)受到影響［6］?；钚匝蹩勺鳛檎T發(fā)劑，引起細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，對(duì)于線粒體的能量代謝有著重要的作用［7］。氧自由基是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路強(qiáng)有力的激活劑。目前MAPK信號(hào)通路對(duì)成熟精子調(diào)控的報(bào)道越來(lái)越多，MAPK屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶系列，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理病理過(guò)程。有報(bào)道，其家族成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和P38MAPK參與精子活動(dòng)力的調(diào)節(jié)，P38MAPK存在于精子尾部中上段［8］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者也研究發(fā)現(xiàn)，ERK和P38MAPK在正常精子和弱精子癥患者精子中均有表達(dá)，ERK、P38MAPK蛋白表達(dá)水平和P38MAPK磷酸化水平在弱精子癥患者組顯著升高，可見(jiàn)P38MAPK/ERK信號(hào)通路與精力活力有著密切關(guān)系［9］，可能是引起精子活力低下的原因。

表2 治療后各組精子ERK及P38MAPK灰度值的比較(±s)

表2 治療后各組精子ERK及P38MAPK灰度值的比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;與弱精組比較:#P＜0.05;與健脾組比較:△P＜0.05;與補(bǔ)腎組比較:$P＜0.05

組 別 ERK/β-actin PERK/β-actin P38/β-actin PP38/β-actin正常組0.44±0.12 0.31±0.12 0.59±0.20 0.32±0.09弱精組 0.77±0.22* 0.30±0.13 0.98±0.22* 0.71±0.13*補(bǔ)腎組 0.58±0.18# 0.29±0.11 0.79±0.19*# 0.58±0.12*#健脾組 0.69±0.21* 0.31±0.09 0.89±0.23* 0.64±0.11*全方組 0.47±0.15#△ 0.32±0.08 0.63±0.21*#△ 0.36±0.08*#△$

圖2 加味天雄散對(duì)弱精子癥患者P-ERK通路的影響

圖3 加味天雄散對(duì)弱精子癥患者P-P38通路的影響

中醫(yī)學(xué)在經(jīng)典著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》里提出腎主生殖的學(xué)說(shuō)，提出“丈夫二八腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽(yáng)和，故能有子”，男性不育癥的治療以補(bǔ)腎為主，我國(guó)學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)的流行病學(xué)研究。大量的病例研究發(fā)現(xiàn)，男性不育癥腎虛患者占總病例的61.4%，可見(jiàn)腎虛為男性不育癥發(fā)病的主要病機(jī)［11］。除腎虛之外，男性不育的發(fā)生也與脾相關(guān)，因?yàn)槠楹筇熘?，氣血生化之源?2］。我們課題組近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，采用脾腎同治能有效提高男性不育癥的臨床療效，證實(shí)補(bǔ)腎健脾法療效優(yōu)于單一補(bǔ)腎法［13］。前期的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，基于補(bǔ)腎健脾治法的加味天雄散能夠提高少弱精子癥模型大鼠精漿SOD活力，降低精漿MDA水平，提高精漿組織中的抗氧化水平，提高精子的活力［14］。

天雄散出自古籍《金匱要略》，首次在虛勞病中提出脾腎同治，提出對(duì)復(fù)雜病證治療的重點(diǎn)是補(bǔ)脾胃、建中氣，以達(dá)治療疾病的目的。健脾補(bǔ)腎法在加味天雄散組方配伍中有良好的體現(xiàn)，白術(shù)、茯苓益氣健脾，肉蓯蓉補(bǔ)腎填精，制首烏補(bǔ)肝腎，菟絲子補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目，從而達(dá)到脾腎同治的效果。為此我們?cè)诒敬窝芯恐幸策M(jìn)行了拆方研究，分為健脾、補(bǔ)腎、全方組，分別比較3種中醫(yī)治法治療弱精子的臨床療效以及對(duì)MAKP信號(hào)通路的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與補(bǔ)腎組、健脾組治療后比較，補(bǔ)腎健脾法組A級(jí)精子和A+B級(jí)精子百分率改善更明顯;與正常組比較，弱精組患者精子ERK蛋白表達(dá)明顯升高;與弱精組比較，全方組ERK蛋白表達(dá)較補(bǔ)腎組降低更為明顯;與正常組比較，弱精組患者精子P38表達(dá)及PP38明顯升高;與弱精組比較，全方組P38表達(dá)及PP38較補(bǔ)腎組降低更為明顯。

本研究以不育中最常見(jiàn)的弱精子癥為載體，進(jìn)行3種中醫(yī)治法的比較，發(fā)現(xiàn)基于補(bǔ)腎健脾法的加味天雄散可以改善弱精子癥患者精子活力，可能與抑制p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。從信號(hào)傳導(dǎo)通路方向研究探討補(bǔ)腎健脾法治療弱精子癥的作用機(jī)制，對(duì)于探索研究脾腎同治法的作用機(jī)制具有重要意義，對(duì)于完善脾腎相關(guān)論、促進(jìn)其理論物質(zhì)基礎(chǔ)研究、提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)有著重要的意義。

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R698+.2

B

1006-3250(2016)06-0788-04

2015-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81202695);中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院優(yōu)勢(shì)病種資助項(xiàng)目(CACMS08Y0025)

耿 強(qiáng)，河北承德人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合男科的臨床與研究。

△通訊作者:郭 軍，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，Tel:010-62835134，E-mail:guojun1126@126.com。