基于小葉嫁接法的草莓病毒癥狀鑒定

韓榮華

摘 要：為了分析幾種主要病毒病在指示植物上的癥狀，利用指示植物UC10、UC5通過草莓小葉嫁接法，檢測草莓病毒癥狀，特別是單一病毒感染指示植物時的癥狀。通過設置多重處理、對照，比較各處理間、處理內癥狀差異，得出病毒在各種指示植物上的癥狀特點。檢測結果表明：首先，此次試驗所檢測的病毒為我國主要草莓病毒，它們是草莓輕型黃邊病毒、草莓斑駁病毒、草莓鑲脈病毒；其次，在嫁接前準備方面總結出一套培育壯苗的方法，可顯著提高葉柄粗度34.76%，提高葉柄長度47.83%，為提高嫁接成活率提供了很大的幫助；再次，在嫁接過程中應用科學高效的嫁接方法，達到了嫁接成活率100%，為后面的癥狀鑒定提供了便利；最后，根據(jù)觀察的癥狀，推測草莓輕型黃邊病毒與草莓鑲脈病毒之間的相互影響關系。

關鍵詞：草莓；病毒；小葉嫁接；指示植物

我國草莓產(chǎn)區(qū)普遍存在的病毒有4種，即草莓斑駁病毒（SMoV）、草莓皺縮病毒（SCrV）、草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）和草莓鑲脈病毒（SVBV）。 草莓感染病毒后，特別是感染單種病毒，大多癥狀不顯著或難以看出什么癥狀，稱為隱癥。 草莓病毒侵染草莓后，主要表現(xiàn)為葉片失綠、畸形、生長量減少、植株矮化、產(chǎn)量下降、品質變劣等。目前，我國草莓產(chǎn)區(qū)中這4種病毒的總侵染株率達80.2%，其中單種病毒侵染株率為41.6%，兩種或兩種以上病毒復合侵染株率為38.6%。單—病毒感染植株可使草莓減產(chǎn)20%～30%，兩種病毒復合感染減產(chǎn)可達50%，栽培年限越長，感染的病毒種類越多，發(fā)病受害程度越重。

目前對草莓病毒的檢測主要有4條途徑，即對栽培植株的外觀性狀直接觀察分析判斷；利用電子顯微鏡直接觀測植株組織中的病毒；利用醫(yī)學上抗血清鑒定法檢測草莓病毒；在特定的指示植株上接種鑒定。由于病毒侵染栽培植株表現(xiàn)的癥狀在不同的生育階段和季節(jié)中不甚一致、明顯，用直接觀察的辦法難以明確判定侵染病毒的種類，電子顯微鏡法和抗血清檢測法操作復雜、要求精密、適用面太窄，而指示植物接種檢測法簡單直接又方便實用。

自從哈雷斯（1942）提出林叢草莓（Fragaria Vesca）可以作為草莓病毒檢測指示植物以來，已確定林叢草莓中的UC4、UC5、UC6以及深紅草莓（Fragaria Virginiana）中的UC10、UC11和UC12共6個單系作為草莓主要病毒檢測的指示植物，并在國際上通用。為了提高檢測的準確性，有時又在草莓病毒檢測指示植物中接種了特定的潛隱型病毒，使有的病毒病癥狀易于顯現(xiàn)。較常用的是Frazier（1974）改進的小葉嫁接法，檢測并保存病毒。

本試驗通過小葉嫁接法鑒定分析幾種主要病毒病在指示植物上的癥狀。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所需材料有指示植物UC10、UC5，生產(chǎn)用的已染病毒草莓苗，以及嫁接用的刀片、70%濃度乙醇、捆綁用塑料條（厚0.08毫米，寬9毫米，長20厘米）、塑料袋（膜）、游標卡尺、數(shù)碼相機等。因組織培養(yǎng)的UC5莖尖取樣不同，株系間有差異，所以UC5分成3個株系，用UC5（1）、UC5（2）、UC5（3）表示。

1.2 嫁接方法

所有嫁接試驗均采用劈接法，具體步驟如下。

1.2.1 準備嫁接材料 選擇嫁接用的接穗與指示植物。準備好嫁接刀片、捆綁用的塑料條。接穗與指示植物盡量粗大，便于操作，其次注意葉齡，指示植物葉齡以葉片充分展開的新功能葉為宜，因為要保證它在嫁接后可生長期足夠長，便于滿足觀察與鑒定的需要。而相對于接穗的葉齡，最好與指示植物葉齡相匹配。如果條件有限，至少選擇在20天內不會自然衰亡的葉片。然后留葉柄3厘米以上采摘接穗，準備嫁接。

1.2.2 切葉 用刀片沿指示植物中間葉片根部兩側斜向內切，兩刀匯于一點，刀口呈“V”字型，刀深小于1毫米，取下中間葉片。然后切接穗，在接穗中間復葉根部沿斜向外方向削去兩側葉片，刀深至少1毫米。然后再沿兩側切口向下削成契型。兩面盡量作到一刀成型、削面平滑。楔型面長在0.8～1.5厘米范圍內，過短影響嫁接成活率；過長捆綁費時，影響工作效率，1.2厘米為最適長度。再于指示植物“V”型切口底端處，向下切至與接穗等長深度，使指示植物切口上端與接穗切口上端相平，或略大于。

1.2.3 捆綁 以事先準備好的塑料條，從下端開始自下而上捆綁。要求每綁一圈前都加力使塑料條拉伸變長，然后再繞圈，隨著捆綁圈數(shù)的增加，可以借助塑料條回縮力量使傷口接合處緊密貼合，有利于成活。綁到上端切口時，注意綁緊，使切口不直接暴露于空氣中，防止失水。然后向下回綁至底端，在底端打結。最后可以不必涂抹凡士林油，即達到保濕效果，因為緊綁的塑料條層層緊貼，完全可以防止透氣、失水，而且節(jié)省材料和時間，提高工作效率。

1.2.4 套袋保濕 嫁接完畢的指示植物應套透明塑料袋保濕。塑料袋高度應高于指示植物5～10厘米，以不限制植株生長為宜。在袋的中下部留有一透氣孔。澆足水后，置于溫度1～20℃環(huán)境中，完全避免太陽直射光。濕度以肉眼觀察：葉片早上結露，中午葉片干燥，袋內壁始終有小水珠為宜。10～14天后揭袋，最少不得低于7天。

2 病毒癥狀鑒定

2.1 草莓輕型黃邊病毒癥狀鑒定

在植株上采摘4枚葉片，分別嫁接到指示植物UC10，UC5（1），UC5（2），UC5（3）上，成為一個處理。記錄分析處理內各指示植物發(fā)病癥狀，發(fā)病時間，及同一指示植物在各處理間的發(fā)病癥狀和發(fā)病時間。

草莓輕型黃邊病毒只發(fā)生在成熟功能葉片前端或葉緣，表現(xiàn)為片狀暗紅色斑。依植物抗性不同及感染輕重不同，有復葉中的單個葉片發(fā)病和多葉同時發(fā)病多種情況。中期紅斑處顏色變褐，葉片病變處變薄，葉綠體徹底死亡，葉片無法光合作用，最終導致整個葉片提早死亡。

通過處理內比較，草莓輕型黃邊病毒在各指示植物上癥狀相似，無明顯差異。處理比較則UC10，易表現(xiàn)癥狀，且潛伏期短，發(fā)病較快。上草莓輕型黃邊病毒較適宜的指示植物。由于株系間差異UC5（2）次之，UC5（1）再次之，UC5（3）無發(fā)病癥狀。

分析原因：可能是由于株系間脫毒有差異，所攜帶的潛隱病毒不同，造成最終同種異株系間表現(xiàn)有差異。

2.2 草莓班駁病毒癥狀鑒定

發(fā)病植株中，幼嫩葉片感病癥狀明顯。前期葉片普遍褪綠；中期生長勢衰退；后期葉片硬質化，并嚴重黃化。三重復葉已展開的嫩葉發(fā)病后，中間葉片靠近葉柄處的葉緣明顯向下反卷，兩側復葉也有不同程度下卷。幼葉葉背靠近葉柄處有硬質黃化斑塊。葉片未展開的幼葉，葉片扭曲，黃化。葉背及葉柄茸毛多而密，不久便枯黃失去生活力。成熟葉片感病后，葉片變薄，失去肉質感，次脈間葉肉凹凸不平，呈波浪狀起伏，造成葉片不同程度扭曲畸形。據(jù)癥狀觀察和數(shù)據(jù)分析UC5（2）癥狀表現(xiàn)較明顯，屬于易感株系，做指示植物效果較好。

2.3 草莓鑲脈病毒癥狀鑒定

癥狀1：觀察本組指示植物，發(fā)病癥狀較統(tǒng)一。草莓鑲脈病毒在指示植物上表現(xiàn)癥狀是：感病指示植物前期大部分葉片均勻褪綠，后期，葉片正面主脈兩側出現(xiàn)不規(guī)則嫩黃色斑，葉片背部相應部位呈暗黃色、硬化。幼齡葉片癥狀尤其明顯，幼葉葉片較小，葉柄較短，葉背、葉柄茸毛較多、較密，葉片變硬質、脆化。整株表現(xiàn)矮化特征，抽生新芽較少，植株生長勢減緩。

綜合試驗過程中各組發(fā)病癥狀分析：發(fā)病的各處理內癥狀相似。有一處理內各指示植物均未發(fā)病。推測原因由于接穗株所攜帶病原數(shù)量差異導致指示植物未發(fā)病。根據(jù)發(fā)病株發(fā)病情況統(tǒng)計得出各指示植物對草莓鑲脈病毒的敏感度由高至低順序為、UC5（1）、UC10、UC5（2）、UC5（3）。

癥狀2：癥狀相似第一組輕型黃邊病毒的癥狀，此癥狀表現(xiàn)比例也較大，但多數(shù)不明顯。結果分析：由于已知接穗帶有草莓鑲脈病毒，對于是否帶有草莓輕型黃邊病毒及其他病毒不確定，但最終又表現(xiàn)出草莓輕型黃邊病毒的典型癥狀，所以可以推論出兩種情況。推論1：接穗中普遍含有草莓輕型黃邊病毒。但從發(fā)病癥狀來看，癥狀均較輕微，不明顯。所以推測，草莓輕型黃邊病毒與草莓鑲脈病毒同時存在時，鑲脈病毒會干擾輕型黃邊病毒的發(fā)病，使之發(fā)病減弱，可以稱這種現(xiàn)象為“拮抗效應”。推論2：接穗中并不攜帶輕型黃邊病毒，指示植物中含有可被激活的隱性病毒。接穗中的鑲脈病毒與指示植物接合，促進了指示植物體內相應隱性病毒發(fā)病，使之處于激活態(tài)，從而表現(xiàn)出非接種病毒癥狀，可以稱這種現(xiàn)象為“活化效應”。

據(jù)癥狀觀察和數(shù)據(jù)分析UC5（2）癥狀表現(xiàn)較明顯，屬于易感株系，做指示植物較好，UC10次之。

3 結論

在嫁接部分，作者總結出一套嫁接流程和兩種育壯苗方法，依此方法操作，在試驗中嫁接成活率可以達到100%。

在病毒癥狀鑒定、分離過程中，通過觀察嫁接之后的指示植物表現(xiàn)，統(tǒng)計并分離出草莓輕型黃邊病毒、草莓斑駁病毒、草莓鑲脈病毒在指示植物上的發(fā)病癥狀。有相同點也有異同點，三種病毒癥狀相同點：葉片都有褪綠表現(xiàn)，指示植物長勢有不同程度衰退。有的病毒癥狀間區(qū)別不大，但通過較仔細的觀察比較，可以發(fā)現(xiàn)它們之間不同之處。草莓輕型黃邊病毒癥狀是：成熟葉片葉緣有黃斑表現(xiàn)；草莓斑駁病毒癥狀是：葉片葉肉有凹凸變化，造成葉片畸形，成熟葉片比幼嫩葉片畸形明顯。草莓鑲脈病毒癥狀是：葉片主脈兩側葉肉呈帶狀黃化，葉片無畸形表現(xiàn)。但是，在實際生產(chǎn)中乃至試驗中常常會遇到某些植株有復合侵染現(xiàn)象，即表現(xiàn)出兩種及兩種以上癥狀。所以給病毒鑒定工作帶來諸多干擾與不便。在初步鑒定、分離出病毒癥狀之后。又用小葉嫁接法對一些生產(chǎn)品種隨機檢測，發(fā)現(xiàn)各病毒在田間感染率及復合感染率都較高，分別占13.3%、36.7%、23.3%、26.7%。

通過草莓小葉嫁接法檢測病毒，在本次試驗中各病毒檢出率普遍在75%以上，檢出率較高，所以在生產(chǎn)上可以應用此方法檢測病毒。但是，前提條件有二：一是保持較高的嫁接成活率，才會及時可靠的得到檢測結果，節(jié)省時間，在最短的時間內拿出治療措施，挽救生產(chǎn)上損失，發(fā)揮出小葉嫁接法應有的作用。二是對指示植物的繁殖和保留要保證較高的純度。本次試驗中UC5分為3個株系，即UC5（1）、UC5（2）、UC5（3），在3個株系中UC5（2）表現(xiàn)往往明顯于其余兩株系，而在檢測輕型黃邊病毒試驗中，UC5（3）株系指示植物中無一株有相應癥狀表現(xiàn)，同樣是采自同一母株的接穗嫁接到UC5（1）、UC5（2）上都有不同程度癥狀表現(xiàn)。所以，在指示植物繁殖與保留上應作到純化。

綜合比較指示植物UC10、UC5。檢測草莓輕型黃邊病毒用UC10效果較好；檢測草莓斑駁病毒、草莓鑲脈病毒用UC5較好。

（責任編輯 亓 國）