超濾濃縮對小新月菱形藻活性的影響

■于建華　周　瑋　王國棟　任紹潔

（1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連116023；3.大連舉揚科技有限公司，遼寧大連116023）

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超濾濃縮對小新月菱形藻活性的影響

■于建華1周瑋2王國棟3任紹潔1

（1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連116023；3.大連舉揚科技有限公司，遼寧大連116023）

摘要：試驗研究了餌料濃縮機在不同操作壓力、不同起始密度對小新月菱形藻（Nitzschiaclos?teriumf.minutissima）進行濃縮后細胞活性的影響。通過超濾技術，利用單胞藻餌料濃縮機對小新月菱形藻進行濃縮，操作壓力為0.10、0.16、0.20 MPa，小新月菱形藻起始密度分別為1.0×106、2.0×106cells/ml，對不同濃縮時間的濃縮藻進行再培養(yǎng)。結果表明，小新月菱形藻起始密度1.0×106、2.0×106cells/ml，采用操作壓力分別為0.20 MPa和0.16 MPa時對藻細胞活性影響最小，藻細胞繁殖速度較快，繁殖密度較大。結果提示，餌料濃縮機在合理的壓力下可以對不同濃度的新月菱形藻進行濃縮，不影響藻細胞的活性。

關鍵詞：超濾；小新月菱形藻；壓力；活性

小新月菱形藻（Nitzschia closteriumf. minutissi?ma）隸屬于硅藻門、羽紋綱、管殼縫目、菱形藻科，菱形藻屬，屬于海洋微藻的一種[1]。小新月菱形藻是很多水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼體生長發(fā)育的優(yōu)良餌料，同時也是很多餌料生物生長繁殖的最佳餌料[2-5]。目前，微藻的培養(yǎng)、投喂一般與生產(chǎn)育苗同時進行，因而育苗的成敗很大程度上取決于是否提供優(yōu)質、充足的微藻。為了解決餌料供應問題，很多學者采用超濾濃縮技術對單胞藻進行濃縮，獲得大量濃縮餌料[6-7]。超濾技術是一種膜分離技術。周瑋研究了超濾技術対金藻的濃縮效果，結果表明適宜的操作壓力下，濃縮效果明顯，對金藻活性不產(chǎn)生影響，且操作簡單、清洗方便[7-9]。但是利用單胞藻餌料濃縮機對小新月菱形藻的濃縮方面的研究報道很少，小新月菱形藻如果在濃縮過程中藻細胞遭到破壞，則營養(yǎng)物質損失，失去了應用價值。本試驗利用大連海洋大學研制開發(fā)的單胞藻餌料濃縮機（MFZ-1）對小新月菱形藻進行濃縮，研究了操作壓力和起始密度對小新月菱形藻細胞活性的影響，為生產(chǎn)上進一步合理利用單胞藻餌料濃縮機提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

單胞藻餌料濃縮機(MFZ-1)、顯微鏡（CX21FS1）、血球計數(shù)板（XB-K-25）。

小新月菱形藻由大連陸源海產(chǎn)科技園單胞藻餌料培養(yǎng)室提供。

1.2試驗方法

1.2.1小新月菱形藻濃縮方法

在不同的餌料培養(yǎng)池中培養(yǎng)小新月菱形藻，使其密度分別達到1.0×106cells/ml和2.0×106cells/ml，藻液體積為10 m3。試驗時，將濃縮機進藻管口、出藻管口放在餌料池中，將出水管口放入其它空水池中。采用0.10、0.16、0.20 MPa進行濃縮，在濃縮過程中，每隔2 h取樣，用血球計數(shù)板在顯微鏡下測定濃縮藻密度。

1.2.2藻類培養(yǎng)及密度測定方法

藻類培養(yǎng)采用f/2培養(yǎng)基進行培養(yǎng)[1]。

藻細胞密度測定：取濃縮藻液樣品，用15%的福爾馬林溶液固定，血球計數(shù)板計數(shù)，每個樣品設兩個平行，取平均值。將所取得的濃縮藻（未使用福爾馬林固定）稀釋到1.0×106cells/ml，接種在1 L三角燒瓶中，接種體積300 ml，每瓶加營養(yǎng)液0.3 ml，設3個平行，搖瓶4次/d，每天下午14：00測定藻細胞繁殖密度，取樣2次，取平均值，試驗進行13 d。未濃縮時（0 h）藻細胞繁殖密度作為對照組。

1.2.3K值計算

K=(ln Nt-ln N0)/t。

式中：K——相對生長常數(shù)(表示生長效率)；

N0——t時間開始時的細胞數(shù)目(×106cells/ml)；

Nt——t經(jīng)過時間后的藻細胞數(shù)目(×106cells/ml);

t——指數(shù)生長期所經(jīng)歷的時間（d）。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS11.5軟件進行相關性檢驗，單因素方差分析和Duncan's法多重比較。以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2　結果

2.1操作壓力對小新月菱形藻繁殖的影響

2.1.1起始密度為1.0×106cells/ml濃縮后藻細胞繁殖情況

操作壓力為0.10 MPa，不同濃縮時間小新月菱形藻生長情況見圖1。由圖1可知，各時間組的生長曲線與對照組（0 h）無明顯差異，符合藻類一次性培養(yǎng)繁殖規(guī)律。經(jīng)過指數(shù)增長期，在第6～7 d藻細胞密度基本上都達到了最大值，各濃縮時間組與對照組藻細胞密度差異不顯著（P>0.05）。

操作壓力為0.16 MPa，不同濃縮時間小新月菱形藻生長情況見圖2。由圖2可知，各時間組藻類的繁殖情況與對照組（0 h）基本一致。濃縮6 h和濃縮8 h組在開始培養(yǎng)的第1 d密度稍低于其它各組，出現(xiàn)了延緩期，但是延緩期較短，經(jīng)過指數(shù)增長期和相對生長下降期后，細胞密度與其它各組無明顯差異。在第6 d，藻類基本上達到了最大值[(473.1± 9.3)×104cells/ml]。濃縮8 h組與其它各組在第3 d時存在差異，細胞密度為(170.2±2.4)×104cells/ml，低于對照組[(201.6±11.9)×104cells/ml]。

圖1　0.10 MPa下濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響

圖2　0.16 MPa下濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響

操作壓力0.20 MPa，不同濃縮時間小新月菱形藻生長情況見圖3。由圖3可知，各時間濃縮組生長曲線與對照組（0 h）存在著差異，這種變化在藻類進入靜止期前較為明顯。藻類出現(xiàn)了不同程度的延緩期，濃縮8 h組延緩期較其它各組時間長，并且指數(shù)增長期不明顯。濃縮8 h時間組與對照組存在著顯著差異(P<0.05)，第7 d時細胞密度為(476.8±8.9)×104cells/ml，與對照組[(490.0±0.1)×104cells/ml]相比差異不顯著。

2.1.2起始密度為2.0×106cells/ml濃縮后藻細胞繁殖情況

操作壓力0.10 MPa，濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響見圖4。由圖4可知，藻類在第1～2 d為延緩期，第2～4 d為指數(shù)增長期，第4～6 d為相對生長下降期，第6～9 d為靜止期，第9～13 d為死亡期。各濃縮時間組與對照組（0 h）生長曲線基本相似，0 h時間組，延緩期較短，其它各組，特別是濃縮8 h組，延緩期較明顯。藻類密度在第6 d基本上達到最大值[（485.7±3.0）×104cells/ml]。

圖3　0.20 MPa下濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響

圖4　0.10 MPa下濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響

0.16MPa條件下，不同濃縮時間小新月菱形藻生長曲線見圖5。由圖5可知，生長曲線與0.10 MPa相似，濃縮組與對照組存在著一定的差異，開始培養(yǎng)的第1～2 d和第8 d差異不顯著（P>0.05）。第7 d時，濃縮8 h組的藻細胞密度低于對照組（0 h），在第8 d時，差異不顯著（P>0.05）。

0.20MPa條件下，不同濃縮時間小新月菱形藻生長情況見圖6。由圖6可知，各濃縮時間組與對照組其生長曲線上存在著顯著的差異。濃縮6 h和濃縮8 h組在1～3 d為延緩期，3～6 d為指數(shù)增長期，6～8 d為相對生長下降期，8～11 d為靜止期，11～13 d為死亡期。

圖5　0.16 MPa下濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響

圖6　0.20 MPa下濃縮時間對小新月菱形藻生長的影響

濃縮2 h組與對照組（0 h）無明顯變化；在進入靜止期之前，濃縮6 h組和濃縮8 h組細胞密度低于對照組，但是進入靜止期后，細胞密度與對照組差別不大；濃縮6 h組和濃縮8 h組生長曲線相似，但是濃縮8 h組各生長階段的藻細胞密度始終低于濃縮6 h組。濃縮8 h時間組顯著低于其它各組（P<0.05）。濃縮8 h組最大密度為(426.0±4.5)×104cells/ml，顯著低于對照組密度[(489.6±7.3)×104cells/ml]（P<0.05）。

2.2操作壓力對小新月菱形藻指數(shù)生長期K值的影響

在不同壓力下，小新月菱形藻指數(shù)生長期K值變化見表1和表2。由表1可知，隨著濃縮時間的延長，K值逐漸變小；隨著壓力的增大，K值逐漸變小。0.20 MPa條件下，濃縮6 h和濃縮8 h時間組K值明顯低于其它各組。

由表2可知，隨著濃縮時間的延長，K值逐漸變?。浑S著壓力的增大，K值逐漸變小。操作壓力0.16 MPa和0.20 MPa，濃縮組K值低于其它各組。

表1　小新月菱形藻在不同壓力下各濃縮時間組K值（1.0×106cells/ml）

表2　小新月菱形藻在不同壓力下各濃縮時間組K值（2.0×106cells/ml）

3　討論

在一定的操作壓力下，濃縮小新月菱形藻再培養(yǎng)生長曲線與標準生長曲線相似（圖1），說明藻液在經(jīng)過濃縮機濃縮之后，大部分藻細胞具有活性，能夠繁殖。起使密度為1.0×106cells/ml時，壓力對小新月菱形藻的藻細胞活性影響較小。當壓力增加到0.20 MPa時，隨著濃縮時間的延長，藻細胞再培養(yǎng)后出現(xiàn)了延緩期（圖3），但是延緩期后，藻類依然達到了與對照組差異不顯著的密度值。藻細胞是活細胞，在進行濃縮過程中，細胞密度不斷增大，藻細胞可能產(chǎn)生胞外產(chǎn)物，互相抑制生長，因此再陪養(yǎng)時，藻細胞需要在新的培養(yǎng)液中適應一段時間，因而出現(xiàn)延緩期。另外，藻細胞在濃縮過程中，壓力越大，濃縮時間越長，藻細胞在超濾膜上堆積的越厚，部分藻細胞由于擠壓作用，產(chǎn)生一定的損傷，因此在0.20 MPa時，濃縮8 h組出現(xiàn)了延緩期。但由于小新月菱形藻細胞外具有硅質的細胞壁[1]，這層硅質的細胞壁對藻細胞起到了一定的保護作用，因此經(jīng)過了短暫的延緩期之后，藻細胞密度仍然達到了很高的值。

藻液起始密度為2.0×106cells/ml時，隨著壓力的增大，各個時間組的藻細胞再培養(yǎng)時密度有一定的差異。當壓力為0.16 MPa時，各時間組的藻細胞密度在靜止期之前有一定的變化，指數(shù)生長期生長速度不同，但經(jīng)過延緩期和指數(shù)生長期后，細胞密度與對照組差異不顯著(見圖5)。操作壓力為0.20 MPa時，濃縮6 h和8 h時間組延緩期較長，到達最大密度時的時間為9 d，高于對照組（7 d），且最大細胞密度值低于對照組，說明藻細胞在0.20 MPa壓力條件下，超濾膜對藻細胞產(chǎn)生了影響。藻液在濃縮過程中，堆積在超濾膜上的藻細胞不斷增加，如果超濾時間短，操作壓力低，則堆積速度較慢；相反，操作壓力大，超濾時間長，藻細胞在超濾膜上堆積速度加快，并壓實，致使部分藻細胞因機械損傷而死亡。因此，藻細胞在8 h濃縮組再培養(yǎng)時，延緩期增加，由于部分藻細胞死亡，因此，藻細胞繁殖速度較低。另外，起始密度較高時，如果采用較高的壓力，濃縮時間太長，小新月菱形藻在濃縮過程中不斷在超濾膜表面壓實，濃差極化現(xiàn)象明顯，有可能使超濾膜受到破壞。宮慶禮等[6]研究表明，適宜壓力條件下，濃縮后小球藻的總脂和脂肪酸的組分及含量的化學成分損失很小。于淑娟等[10]研究表明，在臨界范圍內(nèi)的操作壓力可以減少糖分損失。梁茂雨等[11]、縱偉等[12]指出，適合的操作壓力對保證黃金梨干酒、黃瓜汁的品質是很重要的。本試驗結果表明，合適的操作壓力對藻細胞活性影響較小。

4　結論

利用單胞藻餌料濃縮機對小新月菱形藻進行濃縮時，起始密度低，可以采用0.20 MPa進行濃縮；起始密度高，如果采用0.20 MPa進行濃縮，只有采用短時間（低于6 h）濃縮才能不破壞細胞活性，但是，濃縮時間短，藻細胞濃縮密度低，達不到生產(chǎn)要求，因此高密度濃縮時，采用0.16 MPa進行濃縮效果最佳。

參考文獻

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（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

Effects of ultra-filtration concentration on cell activity in Nitzschiaclosterium

Yu Jianhua, Zhou Wei, Wang Guodong, Ren Shaojie

Abstract：The effects of pressure and density on the cell activity in Nitzschia closterium were re?searched in this experiment. The Nitzschia closterium were concentrated under different pressure of 0.10, 0.16 MPa and 0.20 MPa, different initial density of 1.0×106cells/ml and 2.0×106cells/ml to eval?uate the effects of pressure and initial density on survival of the filtered microalgae which were culti?vated again. The results showed that the cells were growing quickly when the pressures were 0.20 MPa and 0.16 MPa. There were no significant differences in cell activity of the concentrated Nitzschiaclos?terium. The results suggested that the Nitzschia closteriubumwhich were concentrated in the reason?able pressure would grow well.

Key words：ultra-filtration；Nitzschiaclosterium；pressure；activity

收稿日期：2015-10-09

通訊作者：周瑋，教授。

作者簡介：于建華，碩士，研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料。

中圖分類號：S816.34

文獻標識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）02-0051-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.02.011