仔豬抗大腸桿菌性F4ac腹瀉病分子遺傳機理研究進展

張 婷，廖金龍，柴晶黨，葉 丹，歐陽婧

(江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013)

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仔豬抗大腸桿菌性F4ac腹瀉病分子遺傳機理研究進展

張 婷，廖金龍，柴晶黨，葉 丹，歐陽婧*

(江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013)

摘要產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac(ETEC F4ac)是引發(fā)新生和斷奶前仔豬腹瀉病的最主要致病菌，分離和鑒別豬ETEC F4ac受體目的基因及因果突變位點成為豬ETEC F4ac腹瀉抗病育種的關鍵。對仔豬抗大腸桿菌性腹瀉病分子遺傳機理研究進展進行綜述，以期為培育種豬抗腹瀉病新品系奠定理論基礎。

關鍵詞仔豬；ETEC F4ac；遺傳機理

新生及斷奶仔豬腹瀉病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一種常見疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，在一些養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家，新生仔豬腹瀉的發(fā)病率高達75.0%[1]。我國仔豬的腹瀉發(fā)病率也很高，全年平均發(fā)病率為46.5%[2]。研究表明，引發(fā)新生仔豬腹瀉病的致病菌主要是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac(ETEC F4ac)[3]。ETEC F4ac的致病性取決于該致病菌是否與豬小腸上皮細胞表面刷狀緣的受體特異性結(jié)合。當該致病菌與小腸上皮細胞表面刷狀緣結(jié)合后，ETEC F4ac大量繁殖產(chǎn)生腸毒素，所產(chǎn)生的腸毒素致使腸上皮細胞分泌功能亢進，大量水和電解質(zhì)進入腸腔，造成腸腔中大量液體積蓄，超過了腸壁重吸收能力從而引起腹瀉。由此可見，仔豬小腸上皮細胞有無ETEC F4ac受體是仔豬被ETEC F4ac感染時是否發(fā)病的關鍵。無受體豬表現(xiàn)為抵抗型，有受體豬則表現(xiàn)為易感型[4]。分離和鑒別豬ETEC F4ac受體目的基因及因果突變位點成為豬ETEC F4ac腹瀉抗病育種的關鍵。筆者對仔豬抗大腸桿菌性腹瀉病分子遺傳機理研究進展進行了綜述，以期為培育種豬抗腹瀉病新品系奠定理論基礎。

1產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)亞型

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)根據(jù)其侵染特點可分為5種亞型，分別為F4、F18、F5、F6和F41，在這5種亞型病原體中，F(xiàn)4和F18是斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌[5]。F18主要引發(fā)斷奶仔豬水腫病和腹瀉病，而F4主要引發(fā)新生仔豬及早期斷奶仔豬腹瀉病[6]。研究表明，ETEC F18的受體基因為FUT1，F(xiàn)UT1基因在307位點處發(fā)生了A>G突變，該位點的突變決定了F18能否與受體結(jié)合從而導致腹瀉[7]。根據(jù)免疫學特征將ETEC F4分為ab、ac和ad 3種亞型[8]，在這3種亞型中，F(xiàn)4ac是最主要的致病菌[4]。F4ac有2個分子量分別為210和240 ku的分泌型糖蛋白受體[9]，這2種糖蛋白所含的β-連接的半乳糖是F4ac識別受體分子的重要組成部分。鑒別ETEC F4ac受體基因及其因果突變是目前國際上仔豬抗大腸桿菌性腹瀉研究的重點和熱點。

2ETEC F4ac受體基因的定位研究

Gibbons等[10]研究表明，豬ETEC F4ac受體為單基因控制，呈顯隱性遺傳模式。攜帶顯性基因S的仔豬對ETEC F4ac的黏附易感，隱性基因s純合仔豬則表現(xiàn)為抵抗型。F4ac受體基因的定位和鑒別得到了國內(nèi)外的重視。

1995年，Edfors-Lilja等[11]利用歐洲野豬×大白豬資源家系群體為材料，經(jīng)過三代系譜的連鎖分析，將ETEC F4ac受體定位于13號染色體，與Tf基因緊密連鎖，發(fā)現(xiàn)F4ab和F4ac受體位點緊密連鎖，但這2個受體卻位于不同的位點。2002年，Python等[12]以大白豬和大白×長白三代家系為材料，利用13號染色體的微衛(wèi)星標記信息，將ETEC F4ac受體進一步定位于S0068和Sw1030之間，與其中的S0075和Sw225高度連鎖(θ=0.00)。該研究結(jié)果在1年后J?rgensen等[13]開展的基因定位研究中得到了驗證，他們還利用FISH和輻射雜種細胞克隆板技術(shù)揭示ETEC F4ac受體位于13號染色體q41區(qū)(SSC13q41)，分別與人3號染色體的q28～q29和q21區(qū)同源。2009～2011年，Joller等[14]、Jacobsen等[15]和Rampold等[16]先后將ETEC F4ac受體進一步定位于5.7～3.1 cM，通過進一步的區(qū)間定位最終定位到LMLN-S0283較小區(qū)間。

李玉華等[17]利用松遼黑豬和長白豬雜交群為試驗群體，開展了ETEC F4黏附表型分布等研究，Niu等[18]利用松遼黑豬和長白豬雜交群，采用增加微衛(wèi)星標記密度，開展基于家系不平衡檢測的精細定位，將F4ac受體基因定位于豬13號染色體S0283和SW1876區(qū)域約1.6 cM區(qū)間。

Ren等[19]利用自身構(gòu)建的大規(guī)模白色杜洛克×二花臉資源家系群體，通過183個微衛(wèi)星位點和具有ETEC F4ac體外黏附表型的755個F2個體和390個F3個體開展了全基因組連鎖分析、IBD分析及斷點重組分析，將ETEC F4ac受體基因精細定位于13號染色體q41區(qū)(SSC13q41)臨近S0283的約3.5 cM區(qū)域。通過全基因組連鎖定位分析和目的區(qū)域的重組斷點事件分析，將目標區(qū)域縮小至UMNp595與 ALGA0072095之間2.3 Mb區(qū)域。以上工作推動了仔豬ETEC F4ac受體基因的研究進展。

3ETEC F4ac受體位置候選基因研究

鑒別SSC13q41區(qū)域的位置候選基因是目前ETEC F4ac受體研究的重點。大量免疫生化特性研究表明，黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGP)、74 ku的轉(zhuǎn)鐵蛋白(GV74)和小腸中性糖鞘H(mLad)符合ETEC F4ac受體的理化特征，其中黏蛋白型唾液糖蛋白與F4ab 和F4ac結(jié)合，但不與F4ad結(jié)合，且該糖蛋白的存在與新生仔豬對ETEC F4ab或F4ac的敏感性高度相關[5]，因而成為ETEC F4ac受體候選基因選擇的重要依據(jù)。Kreuzev等[20]在獲得ETEC F4ac受體基因染色體定位信息后，選擇黏附素糖蛋白編碼基因(MUC基因家族)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)進行研究，Python等[12]對TFRC、B3GnT5、B4GALT4和B4GALT4 4個基因進行了研究，但未發(fā)現(xiàn)與F4ac黏附表型顯著相關的候選基因和標記。

J?rgensen等[13]在歐洲野豬×大白豬資源家系群體中，發(fā)現(xiàn)了Mucin4基因內(nèi)含子7的一個SNP標記與ETEC F4ac的黏附表型共分離。Peng等[21]與J?rgensen等[13]就該位點的影響效應開展了合作科研，發(fā)現(xiàn)該標記在所構(gòu)建的白色杜洛克×二花臉資源家系始祖動物中無多態(tài)性，而Peng等[21]的家系F2個體中有充分分離的ETEC F4ac黏附表型，這表明該SNP標記只與ETEC F4ac受體基因因果突變(causative mutation)呈一定連鎖不平衡的分子標記，不能解釋所有群體的ETEC F4ac受體遺傳基礎。

在精細定位基礎上，Ren等[19]構(gòu)建了包括20個功能基因座位的SSC13q41人-豬高分辨率比較基因圖譜，并先后對該區(qū)域內(nèi)的黏附素13(MUC13)、黏附素20(MUC20)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TFRC)3個位置候選基因開展了研究，雖獲得了一些可喜的結(jié)果，但未鑒別到與ETEC F4ac易感/抗性表型共分離的多態(tài)位點。Huang等[22]利用比較基因組法在該區(qū)域的黏附素4(MUC4)基因中開發(fā)了一個STS(sequence tagged site)，并在位于內(nèi)含子區(qū)鑒別到一個與ETEC F4ac易感/抗性雖非共分離但呈強相關的SNP位點。

筆者采用豬60K芯片，利用其中39720個有效SNPs開展全基因組關聯(lián)分析結(jié)合連鎖與連鎖不平衡分析，揭示MUC13基因為最可能的目的基因。在包括MUC13基因的2.3 Mb區(qū)域進一步搜尋和鑒別了193個SNPs標記，利用這些標記在已經(jīng)黏附表型測定的分布于10省(市)12個中國地方豬種和3個西方商業(yè)豬種共292個無相關個體中開展關聯(lián)分析，結(jié)果支持MUC13基因為目的基因。針對MUC13基因進一步試驗表明，MUC13基因編碼2個轉(zhuǎn)錄本(MUC13A 和MUC13B)，2個轉(zhuǎn)錄本對應的等位基因MUC13A和MUC13B之間的差別在于其第2外顯子所含的高度串聯(lián)重復區(qū)和側(cè)翼的內(nèi)含子68 bp缺少，利用內(nèi)含子68 bp缺少差異作為標簽標記，在大樣本無相關個體中進行分析，結(jié)果表明，所有124 頭對F4ac抗性個體均為MUC13A純合子，而所有對F4ac易感的594頭豬至少含有一個MUC13B等位基因，進一步支持了MUC13為目的基因[23]。

Ren等[19]進一步通過qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)MUC13基因的表達量與黏附表型無關，由此推斷MUC13基因的因果突變屬于引起MUC13基因功能改變的編碼突變。進一步對除MUC13基因高GC含量、高度串聯(lián)重復的PTS區(qū)(富含脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的區(qū)域)外的所有基因區(qū)域進行SNPs搜尋，鑒別到22個cSNPs和55個內(nèi)含子突變，將這些SNPs在遠緣群體中開展關聯(lián)分析，結(jié)果無一個與表型共分離SNP。由此推斷MUC13基因的因果突變極有可能位于高度串聯(lián)重復的PTS區(qū)。另外根據(jù)MUC型家族其他成員的研究，高度串聯(lián)重復的PTS區(qū)構(gòu)成MUC的糖基化結(jié)合位點，該位點賦予MUC重要的生物功能，因此，串聯(lián)重復的數(shù)目、長度及序列變異都將影響到糖基化的程度及類型，由此影響MUC蛋白的功能。由此可以判斷MUC13基因的因果突變位于高度串聯(lián)重復的PTS區(qū)。

Fu等[24]開展了基于GWAS分析的ETEC F4ac受體基因精細定位，將目標區(qū)域定位至2.6 Mb區(qū)域，進一步確定該區(qū)域中的TNK2、ZNF148、HEG1、MUC13 和ITGB5 為最有可能的位置候選基因。Zhou等[25]將ETEC F4ac受體最重要的候選基因ITGB5和MUC13采用基因沉默策略開展功能分析，進一步證實了ITGB5和MUC13基因在ETEC 黏附過程中發(fā)揮重要的作用。

Goetstouwers等[26]以大白、比利時長白以及大白與比利時長白的雜交豬種為研究對象，通過體外ETEC的鞭毛黏附性試驗以及全基因組關聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)ETEC F4ac 的受體可能位于MUC13基因的鄰近區(qū)域。

4展望

雖然目前仔豬抗ETEC F4ac腹瀉目的基因鑒別取得了重大突破，對多個位置候選基因尤其是MUC13基因也開展了許多卓有成效的試驗，仍有以下尚未解決的關鍵問題：①真正的目的基因及其因果突變位點(causative mutation)尚未鑒別到；②因果突變位點功能分析尚未進行；③因果突變位點的遺傳起源進化也有待研究。因而對于真正解析豬F4ac腹瀉病分子機理而言，尚需開展大量深入的研究?？梢圆捎矛F(xiàn)代分子生物學技術(shù)如通過目標區(qū)域捕獲測序或長片段擴增子測序等技術(shù)結(jié)合功能分析策略鑒別到目的基因及其因果突變位點，深入解析其分子機理及遺傳進化，進而全面揭示豬F4ac侵染腹瀉的抗病分子遺傳機理，為培育種豬抗腹瀉病新品系奠定理論基礎。

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基金項目江西省自然科學基金項目(20143ACB21006 )；江西省教育廳科技項目(GJJ14571)；江西科技師范大學大學生創(chuàng)業(yè)、科研基金項目(20140801007，20140804075)。

作者簡介張婷(1988- )，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事分子抗病遺傳育種研究。

收稿日期2016-03-22

中圖分類號S 852.6

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-144-02

Research Progress of the Molecular Genetic Mechanism Resistant to ETEC Diarrhea Disease in Piglet

ZHANG Ting, LIAO Jin-long, CHAI Jing-dang, OUYANG Jing*et al

(College of Life Science, Jiangxi Science & Technology Normal University, Nanchang, Jiangxi 330013)

AbstractEnterotoxigenic Escherichia coli F4ac (ETEC F4ac) were major causes of diarrhea in piglets. Therefore, identification and isolation of piglet ETEC F4ac Receptor genes and causal mutations were the keys to diarrhea disease resistance breeding of piglet ETEC F4ac. In this research, the research progress on the molecular genetic mechanism resistant to ETEC diarrhea disease in piglet was reviewed, aiming at providing references for the research on new lines cultivation of anti-diarrhea piglet.

Key wordsPiglet; ETEC F4ac; Genetic mechanism