化學(xué)品綠色制造核心技術(shù)——合成生物學(xué)

肖文海，王穎，元英進

（1天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；2天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)平臺，天津 300072）

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化學(xué)品綠色制造核心技術(shù)——合成生物學(xué)

肖文海1,2，王穎1,2，元英進1,2

（1天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；2天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)平臺，天津 300072）

摘要：合成生物學(xué)即生物學(xué)的工程化，因其打破了非生命化學(xué)物質(zhì)和生命物質(zhì)之間的界線，推動了生命科學(xué)由理解生命到創(chuàng)造生命的革新，因此對科學(xué)發(fā)展和技術(shù)創(chuàng)新起到了顛覆性作用，引發(fā)了化學(xué)品綠色制造的巨大變革。合成生物學(xué)作為化學(xué)品綠色制造的核心技術(shù)，主要從原料到菌種再到過程進行全鏈條設(shè)計和優(yōu)化。本文首先從原料多樣化、產(chǎn)品的合成與底盤細(xì)胞的選擇這三個方面，綜述了化學(xué)品綠色制造過程中合成生物學(xué)所起到的關(guān)鍵核心作用。在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)闡述了人工體系的設(shè)計與構(gòu)建，并對今后如何通過發(fā)展合成生物學(xué)來促進化學(xué)品綠色制造，從“原料、底盤細(xì)胞、反應(yīng)過程”這三個方面提出了相應(yīng)的展望。

關(guān)鍵詞：合成生物學(xué)；化學(xué)品制造；生物能源；藥物；原料；底盤細(xì)胞；生物過程

1 合成生物學(xué)的顛覆性特征及對化　　學(xué)品綠色制造的影響

圖1 合成生物學(xué)對科學(xué)發(fā)展與技術(shù)創(chuàng)新的顛覆性影響Fig.1 A disruptive role played by synthetic biology in development of science and technology

合成生物學(xué)，即生物學(xué)的工程化。該技術(shù)突破自然進化的限制，以“人工設(shè)計與編寫基因組”為核心，可針對特定需求從工程學(xué)角度設(shè)計構(gòu)建元器件或模塊。通過這些元器件對現(xiàn)有自然生物體系進行改造和優(yōu)化，或者設(shè)計合成全新可控運行的人工生物體系[1-7]。合成生物學(xué)是“自下而上”的研究體系，對科學(xué)發(fā)展產(chǎn)生了革命性和顛覆性影響（圖1）。一方面，合成生物學(xué)打破了非生命化學(xué)物質(zhì)和生命物質(zhì)之間的界線。該技術(shù)以“工程化設(shè)計與模塊化制造”為導(dǎo)向，從脫氧核苷酸出發(fā)，經(jīng)DNA小片段到DNA大片段乃至到整個基因組，從單一零散的元器件到功能模塊再到整個生命系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，“自下而上”地逐級構(gòu)筑生命活動，實現(xiàn)從非生命物質(zhì)到生命體系的跨越[8-10]。另一方面，合成生物學(xué)革新了當(dāng)前生命科學(xué)的研究模式。從以DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和“遺傳中心法則”的提出為代表的生物學(xué)第一次革命，到以測序技術(shù)的發(fā)明和“人類基因組”計劃的誕生為標(biāo)志的生物學(xué)第二次革命，整個生物學(xué)研究體系一直延續(xù)“從整體到局部”、“自上而下”、逐級深入的研究模式。盡管這種研究模式促進人們逐步理解微觀生物分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝物）之間的相互作用以及這些分子與生物功能的內(nèi)在聯(lián)系，但依舊難以解析生物體內(nèi)協(xié)調(diào)有序的運行模式和生物由簡單到復(fù)雜的進化歷程。代表了生物學(xué)第三次革命的合成生物學(xué)應(yīng)運而生，提出了“從局部到整體”、“自下而上”的研究思路，即通過構(gòu)建人工生物系統(tǒng)，總結(jié)人造生命設(shè)計構(gòu)建的原理和規(guī)律，以一個全新的視野角度，對天然生物系統(tǒng)的工作原理和運行規(guī)律，乃至生物起源進化、生物結(jié)構(gòu)和生物功能等生物學(xué)重大基本問題進行研究和解析。因此，合成生物學(xué)實現(xiàn)了生命科學(xué)由理解生命到創(chuàng)造生命的革新，而生命科學(xué)從讀取自然生命信息發(fā)展到寫出人工生命信息的時代。

合成生物學(xué)從起初的概念驗證階段（大規(guī)模合成、編輯基因組和生物學(xué)研究工程化）發(fā)展到目前對化學(xué)品綠色制造的促進階段。世界各國政府和權(quán)威評估機構(gòu)日益關(guān)注和重視合成生物學(xué)及其對生產(chǎn)大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品以及高附加值的生物醫(yī)藥產(chǎn)品的推動作用（圖1）[11]。麥肯錫研究所和達沃斯論壇將合成生物學(xué)定為顛覆性技術(shù)，預(yù)測該技術(shù)將驅(qū)動相關(guān)市場和全球經(jīng)濟的革命性發(fā)展。2014年5月美國國防部將合成生物學(xué)技術(shù)列為21世紀(jì)優(yōu)先發(fā)展的六大顛覆性技術(shù)之一[12]；2013年美國能源部對美國國會發(fā)表合成生物學(xué)國會報告[13]；2015年美國發(fā)布了《生物技術(shù)工業(yè)化：化學(xué)品先進制造路線圖》，將合成生物學(xué)列為核心發(fā)展技術(shù)[14]。麥肯錫全球研究所發(fā)布的研究報告將合成生物學(xué)評價為未來的十二大顛覆性技術(shù)之一，預(yù)測2025年合成生物學(xué)和工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)值將達到1000億美元左右[15]。英國商業(yè)創(chuàng)新技能部將合成生物學(xué)列為未來的八大技術(shù)之一，預(yù)測2020年合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)規(guī)模將達620億英鎊[16]。

合成生物學(xué)的顛覆性已經(jīng)引發(fā)以“設(shè)計-構(gòu)建-檢驗”循環(huán)為特征的產(chǎn)業(yè)革命。2015年美國發(fā)布了《生物技術(shù)工業(yè)化：化學(xué)品先進制造路線圖》，化學(xué)品的先進制造受到越來越多的關(guān)注。化學(xué)品制造已經(jīng)開始原料路線由化石資源向可再生生物資源轉(zhuǎn)移、加工路線由化學(xué)制造向生物制造轉(zhuǎn)移的變革。高能耗、高污染、大規(guī)模的傳統(tǒng)化學(xué)品制造工業(yè)已經(jīng)不能適應(yīng)社會發(fā)展的需要。2015年5月8日，我國國務(wù)院發(fā)布《中國制造2025》，這是中國版的“工業(yè)4.0”規(guī)劃。該規(guī)劃在生物醫(yī)藥重點領(lǐng)域提出了“全面推進綠色制造”的重點任務(wù)，將努力構(gòu)建“高效、清潔、低碳、循環(huán)”的綠色制造體系。而利用合成生物學(xué)設(shè)計、構(gòu)建化學(xué)品合成人工生物體系，同時可以高效利用傳統(tǒng)工藝不能利用的生物質(zhì)資源，尤其是工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活廢棄物，降低對化石資源的依賴，減少廢棄物的排放，以利于環(huán)境資源的保護。因此，顛覆性的合成生物學(xué)必將作為生物經(jīng)濟發(fā)展的新興技術(shù)，驅(qū)動我國未來化學(xué)品先進制造和生物經(jīng)濟的革命性發(fā)展。

2 化學(xué)品綠色制造過程中合成生物學(xué)的作用

合成生物學(xué)是綠色制造的核心，主要從原料到菌種再到過程進行全鏈條設(shè)計和優(yōu)化。不同于傳統(tǒng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)模式，化學(xué)品先進制造并非依賴于對產(chǎn)物天然合成菌株進行優(yōu)化，而是重新合成全新的人工生物體系，將原料以較高的速率最大限度地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物[17-18]。整個生產(chǎn)鏈條可分為原料的利用、底盤細(xì)胞的選擇和優(yōu)化以及產(chǎn)品的生產(chǎn)3個部分（圖2）。

圖2 化學(xué)品綠色制造過程Fig. 2 Chemicals green manufacturing process

2.1 原料多樣化對合成生物學(xué)提出的要求

作為發(fā)酵過程中首要元素，碳源是決定化學(xué)品生物制造，特別是大宗化學(xué)品和生物燃料這類附加值低但市場需求量極大的化合物合成成本的關(guān)鍵因素[18]。最為常用的碳源為糖類，特別是葡萄糖。但是淀粉來源糖類的大量使用，引發(fā)了“食品與能源”的矛盾，也有成本問題。化學(xué)品綠色制造倡導(dǎo)使用農(nóng)業(yè)、工業(yè)、林業(yè)的副產(chǎn)物或廢棄物，例如纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等。木質(zhì)纖維素經(jīng)過物理化學(xué)預(yù)處理（如稀硫酸、氨氣爆破、蒸汽爆破等）或生物酶（纖維素酶和半纖維素酶等）水解后，產(chǎn)物不僅有葡萄糖、甘露糖、半乳糖等六碳糖，還有木糖、阿拉伯糖等五碳糖，水解液中還含有多種毒性副產(chǎn)物（如乙酸、糠醛、酚類等）。因此，應(yīng)用于化學(xué)品生物制造的底盤細(xì)胞必須兼具同時高效利用五碳糖和六碳糖的能力以及對復(fù)合抑制劑的耐受能力。Jin 等[19]將五碳糖、六碳糖利用和乙酸還原路徑一起整合到釀酒酵母細(xì)胞中，實現(xiàn)了纖維二糖、木糖和乙酸的同時利用來生產(chǎn)乙醇，這為最終實現(xiàn)木質(zhì)纖維素的利用打下了良好的基礎(chǔ)。此外，還可以通過人工構(gòu)建混菌培養(yǎng)體系來實現(xiàn)五碳糖和六碳糖的協(xié)同利用[20]。在如何提高底盤細(xì)胞對抑制劑的耐受方面，對抑制劑耐受機制的解析和功能模塊的抽提是目前研究的主要方向。例如Sa-Correia等[21]通過篩選釀酒酵母單基因敲除突變庫發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及鉀離子、葡萄糖等物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可顯著影響釀酒酵母對乙酸的耐受性，但與乙酸耐受直接相關(guān)的基因仍需進一步解析。

大氣層中含量最豐富碳?xì)浠衔锛淄楹蜏厥覛怏w的主要成分CO2及其衍生物甲醇、合成氣、甲酸等C1原料也是化學(xué)品制造的重要原料來源。光合自養(yǎng)型微生物可直接利用光能固定CO2，合成糖等有機物。例如，可以利用藍(lán)細(xì)菌以CO2為底物，通過光合發(fā)酵合成甘油三脂[22]。甲烷短桿菌屬、甲烷球菌屬、甲烷微菌屬和甲烷八疊球菌屬的微生物可固定CO2合成甲烷。但該反應(yīng)需在厭氧條件下進行，并需要氫氣等強還原氣體[23-24]。以甲烷單加氧酶為特征酶的甲烷氧化菌，可將甲烷依次氧化生成甲醇、甲醛、甲酸和CO2。中間代謝產(chǎn)物甲醛可通過磷酸戊糖途徑或絲氨酸途徑進入同化代謝途徑，合成乙酰-CoA等重要中心代謝產(chǎn)物[25]。甲烷氧化菌在營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不均衡時可以合成聚羥基脂肪酸（可降解塑料）[26-28]。因此，甲烷氧化菌是一種適用于能源及可降解塑料生產(chǎn)的底盤菌株。若要在化學(xué)品生物制造中有效利用CO2、甲烷等C1原料，一方面需要對可利用天然C1原料的微生物進行實驗室馴化，有針對性地開發(fā)遺傳操作系統(tǒng)和合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)平臺；另一方面，需針對常用底盤細(xì)胞，研究C1原料利用最小模塊。例如在分析天然光合作用的基礎(chǔ)上，設(shè)計、構(gòu)建最小CO2固定模塊，以期通過模擬并改造光合作用固碳過程，利用CO2和太陽能合成產(chǎn)品[18]。

2.2 通過合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)的重大產(chǎn)品

作為化學(xué)品綠色制造的核心技術(shù)，合成生物學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類化學(xué)品的生產(chǎn)中，如大宗化學(xué)品、生物能源、食品添加劑和生物醫(yī)藥等。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成以及代謝工程技術(shù)相比，在化學(xué)品制造領(lǐng)域，合成生物學(xué)技術(shù)在非天然分子生物合成、新的代謝通路的創(chuàng)建和代謝路徑異源構(gòu)建方面有著特有的優(yōu)勢。

① 合成生物學(xué)可以通過不同生物來源的元件和模塊的設(shè)計和組合，合成非天然分子。Zhang等[29]通過在大腸桿菌體內(nèi)人工構(gòu)建非天然分子β-甲基-δ-戊內(nèi)酯的合成代謝通路，即在甲羥戊酸代謝途徑的基礎(chǔ)上引入了來自煙曲霉的乙酰-CoA連接酶編碼基因sidI和烯酰-CoA水合酶編碼基因sidH以及酵母來源的烯醇還原酶編碼基因oye2，實現(xiàn)β-甲基-δ-戊內(nèi)酯的生物合成。該非天然分子經(jīng)過后續(xù)的化學(xué)修飾和聚合能夠形成一種較聚乙烯、聚苯乙烯彈性更佳的新型材料[29]。

② 合成生物學(xué)根據(jù)工程學(xué)和反應(yīng)的原理，可以人工設(shè)計非天然存在的代謝路徑，進而合成所需目標(biāo)產(chǎn)物或者實現(xiàn)特定的功能。Zhao等[30]在大腸桿菌中引入了來源于戊糖乳桿菌的乳酸脫氫酶編碼基因d-ldh和大腸桿菌內(nèi)源羥化酶混合物編碼基因hpaBC，成功創(chuàng)建了從酪氨酸到丹參酸A的非天然代謝通路，并且通過上調(diào)丹參酸A合成模塊的表達量以及阻斷競爭代謝通路，最終使丹參酸A的產(chǎn)量達到7.1 g·L-1。Toshiaki等[31]通過在羅爾斯通氏菌中同時引入丁烯醇-CoA羧化酶編碼基因ccr、中等長度碳鏈烯酰-CoA水合酶編碼基因 phaJ4a以及丙二酸單乙酯酰-CoA脫羧酶編碼基因emd，人工構(gòu)建了從果糖到聚(R)3-羥基丁酸-(R)3-羥基己酸[poly((R)-3-hydroxybutyrate-co-(R)-3-hydroxyhexanoate)，P(3HB-co-3HHx)]的代謝途徑，最終獲得了可以生產(chǎn)富含C6單體（HHx）的菌株。

③ 合成生物學(xué)可以在改造和優(yōu)化天然表達體系的同時，將動物源和植物源的代謝路徑構(gòu)建到微生物體系中，最終實現(xiàn)目標(biāo)代謝物的異源表達。Ajikumar等[32]在大腸桿菌中構(gòu)建了來自于植物紅豆杉中的紫杉二烯合成途徑，并通過模塊調(diào)諧使紫杉二烯的產(chǎn)量提高了6000倍。Leonard等[33]通過合成生物學(xué)技術(shù)將來自銀杏樹中的左旋海松二烯合成途徑成功構(gòu)建在大腸桿菌中，并且通過與蛋白質(zhì)工程相結(jié)合的底盤菌株優(yōu)化，使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量達到約800 mg·L-1。2003年，法國國家科學(xué)研究所分子遺傳學(xué)中心的Denis Pompon與Transgene 公司合作研究，通過引入哺乳動物蛋白源蛋白 matP450scc (CYP11A1)、matADX、matADR以及線粒體靶向的ADX、CYP11B1、3βHSD、CYP17A1和CYP21A1,首次實現(xiàn)了釀酒酵母中氫化可的松的全生物異源合成[34]。

在化學(xué)品制造領(lǐng)域，合成生物學(xué)在不斷創(chuàng)造新分子、創(chuàng)建新的代謝通路以及豐富可異源表達的化學(xué)品種類的同時，對相應(yīng)化學(xué)品的產(chǎn)業(yè)化也有著極大的促進作用，已經(jīng)有很多項目達到或者接近產(chǎn)業(yè)化水平[18]。表1中列出目前有代表性的一些生物制造化學(xué)品及其生產(chǎn)公司和研發(fā)現(xiàn)狀。這些產(chǎn)品包括市場需求大的生物燃料（例如生物柴油、生物航空燃油、丁醇、異丁醇）和大眾化學(xué)品（例如1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、聚羥基脂肪酸酯、丁二烯），也包括高附加值的食品添加劑（例如瓦倫烯、諾卡酮、香豆素、白藜蘆醇、藏紅花素、甜菊糖）和藥物（青蒿素、頭孢氨芐、糖尿病治療藥物EV-077、抗生素EV-035）。其中，1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、異丁醇、生物柴油和生物航空燃油、瓦倫烯、諾卡酮、香豆素、青蒿素、頭孢氨芐等產(chǎn)品項目已經(jīng)達到商業(yè)化規(guī)模，進入實際投產(chǎn)階段（表1）。

表1 化學(xué)品合成生物制造示例Table 1 Examples of chemicals bio-manufacturing

2.3 底盤細(xì)胞的選擇和優(yōu)化

在合成生物學(xué)的推動下，人工細(xì)胞將逐步取代目標(biāo)產(chǎn)物天然合成菌株，成為化學(xué)品生物制造鏈條的核心。根據(jù)特定需求（例如底物、產(chǎn)品、生產(chǎn)過程等）設(shè)計的人工細(xì)胞，是實現(xiàn)化學(xué)品先進制造“能效提升、清潔生產(chǎn)、循環(huán)利用”的基礎(chǔ)。由于具備安全性、魯棒性（遺傳穩(wěn)定性和性狀穩(wěn)定性）、適于高密度發(fā)酵、遺傳背景清晰、基因操作體系成熟等特點，大腸桿菌、釀酒酵母等模式微生物常被用來構(gòu)建用于化學(xué)品綠色制造的底盤細(xì)胞。不同的宿主系統(tǒng)由于其自身的特性，往往偏好于合成某一類產(chǎn)物[35]。以大腸桿菌和釀酒酵母為例。盡管大腸桿菌適合于合成萜類碳骨架，但由于它在蛋白表達時缺乏后續(xù)修飾能力[36]且沒有完善的內(nèi)膜系統(tǒng)，因此在表達真核細(xì)胞來源的蛋白過程中受到限制[37]；而作為真核生物的酵母，具有優(yōu)于細(xì)菌的蛋白表達和修飾能力和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等完整的內(nèi)膜系統(tǒng)，更適合作為復(fù)雜天然產(chǎn)物異源合成的宿主平臺。例如在青蒿素合成中，釀酒酵母比大腸桿菌能提供更多的前體物質(zhì)[38]。對于合成生物能源來說，大腸桿菌由于胞內(nèi)脂肪酸含量高、脂肪酸合成速率高以及可將脂肪酸及其衍生物分泌到胞外的特性，適于合成脂肪酸及其衍生物；而釀酒酵母由于有機溶劑耐受性高、天然具備合成乙醇的能力，適于合成乙醇、丁醇、異丁醇等醇類物質(zhì)及其衍生物[39]。

底盤菌株若要滿足實際生產(chǎn)的需要，還需具備抗逆性好（耐受滲透壓、pH、溫度、醇、乙酸等）、底物選擇范圍廣等特性，以應(yīng)對復(fù)雜、非理想化的實際生產(chǎn)環(huán)境[18]。這些特性一般不是這些模式生物天然具備的，需構(gòu)建相應(yīng)的耐受模塊和原料轉(zhuǎn)運同化模塊導(dǎo)入宿主細(xì)胞中予以實現(xiàn)[40]。同時人們還致力于馴化、開發(fā)具有高耐受性或特殊原料選擇性（特別是光合自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型生物）的非模式微生物作為宿主菌株，以構(gòu)建生產(chǎn)特定產(chǎn)品的底盤細(xì)胞[22]，發(fā)展經(jīng)濟、綠色、高效、穩(wěn)定的生產(chǎn)過程。

人工混菌體系也是一類很好的底盤體系。人工混菌體系與單細(xì)胞體系相比，尤其是在構(gòu)建長的代謝通路或者完成更為復(fù)雜的功能方面有著如下3個方面的優(yōu)點：① 混菌體系中細(xì)胞間作用關(guān)系處于動態(tài)平衡，對環(huán)境波動更具強的適應(yīng)性和穩(wěn)定性；②混菌體系中不同細(xì)胞功能分工，適于同時完成多項復(fù)雜工作；③ 不同來源、不同功能的元件和模塊可以在不同細(xì)胞中構(gòu)建，既減輕對單細(xì)胞底盤的代謝負(fù)荷，又便于將功能分區(qū)、避免功能間的交叉影響[41]。2015年美國麻省理工學(xué)院的Gregory Stephanopoulos教授課題組[42]將萜類代謝途徑構(gòu)建到大腸桿菌-釀酒酵母的人工混菌體系中，成功實現(xiàn)了抗癌藥物紫杉醇重要前體Taxa-4(20), 11(12)-dien-5alpha-acetoxy-10beta-ol的大量積累，產(chǎn)量達到33 mg·L-1，為最終實現(xiàn)紫杉醇的異源生物合成奠定了堅實的基礎(chǔ)。同時該工作研究者還證明，所構(gòu)建的混菌體系同樣適用于其他萜類物質(zhì)的合成，例如合成香料諾卡酮和藥品丹參酮的重要前體鐵銹醇[42]。

3 化學(xué)品制造人工體系的設(shè)計與構(gòu)建

在合成生物學(xué)“自下而上”的研究策略指導(dǎo)下，化學(xué)品制造人工體系將遵循“工程化設(shè)計與模塊化制造”的原則，根據(jù)理性設(shè)計，采用標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件，構(gòu)建通用型的功能模塊，在一定的底盤生物上組裝成為具有特定功能的人工制造體系[18, 35, 43]，并對功能模塊與底盤進行適配，以實現(xiàn)人工體系運行效率的最優(yōu)化（副產(chǎn)物生成率低、底物轉(zhuǎn)化效率高、終端產(chǎn)物生成速率高、生物量高、魯棒性好）。其具體設(shè)計和構(gòu)建流程分為以下3個方面（圖3）。

圖3 化學(xué)品制造人工體系的設(shè)計與構(gòu)建Fig. 3 Design and construction of artificial system for chemicals manufacturing

3.1 合成模塊的設(shè)計與構(gòu)建

這一環(huán)節(jié)包括元器件設(shè)計優(yōu)化和模塊設(shè)計組裝。根據(jù)產(chǎn)品合成路徑中不同的反應(yīng)步驟，設(shè)計各個功能模塊。在這里不僅要注重產(chǎn)品的合成路徑，也要兼顧原料的轉(zhuǎn)運和同化過程，并按照實際需求引入相應(yīng)模塊，例如糖轉(zhuǎn)運和代謝模塊、生物質(zhì)降解模塊、光合作用固碳模塊等。其中，由于纖維素等生物質(zhì)的降解過程發(fā)生在胞外，所以還需要引入蛋白分泌表達系統(tǒng)模塊，并考慮在底盤細(xì)胞表面構(gòu)建優(yōu)化支架蛋白、錨定蛋白等纖維素結(jié)合模塊系統(tǒng)[44]。在構(gòu)建合成模塊時，需將不同的啟動子、核糖體結(jié)合位點、終止子、功能基因、選擇標(biāo)簽等具有特定功能的序列進行標(biāo)準(zhǔn)化、元件化[45]。其中，編碼具有特定功能蛋白的基因序列，需考慮不同來源的同工酶在催化活性和底物、產(chǎn)物特異性上的差異，并按照宿主菌株的密碼子偏好性對選定的蛋白序列進行優(yōu)化。然后按照既定設(shè)計，選取特定的元器件進行拼接組裝[8, 46]，進而構(gòu)建合成模塊。

3.2 底盤細(xì)胞的功能優(yōu)化

在這一環(huán)節(jié)中，根據(jù)不同產(chǎn)品及相應(yīng)制造需求（原料利用、生產(chǎn)環(huán)境、合成途徑等），選擇合適的宿主菌株，并將特定需求細(xì)化到細(xì)胞具體的代謝改造上。這里對底盤細(xì)胞的優(yōu)化要考慮以下幾個方面：① 胞內(nèi)代謝流的流向和分配：通過減弱非必需旁路途徑、抑制產(chǎn)物的分解、上調(diào)前體的合成通路等，增強從底物到產(chǎn)物的代謝流，并使代謝流直接從底物流向產(chǎn)物；② 抗逆性：例如使細(xì)胞耐受單一或者復(fù)雜生產(chǎn)環(huán)境，耐受具有生理毒性的底物、產(chǎn)物或中間代謝物；③ 低氧狀態(tài)下氧的高效吸收和利用；④ 輔因子和能量平衡；⑤ 終端產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運[18,35,43]。除引入并過表達相應(yīng)的功能模塊、敲除或下調(diào)旁路競爭途徑和導(dǎo)致產(chǎn)物降解的編碼基因[18, 35, 43]，還可考慮通過空間結(jié)構(gòu)調(diào)控（即蛋白融合和蛋白重定位）產(chǎn)物合成模塊中的蛋白，以增強產(chǎn)物合成路徑的代謝流量[43, 47-48]。

傳統(tǒng)改良菌株性狀的方法是紫外線照射或化學(xué)隨機誘變。現(xiàn)在可以通過基因組重構(gòu)引入相應(yīng)的功能模塊，以彌補底盤細(xì)胞功能的缺陷。同時，還可以借鑒代謝工程中“自上而下”的底盤優(yōu)化思路，通過諸如CRISPR-Cas系統(tǒng)[49-51]、MAGE[52]等染色體編輯技術(shù)[53]，在基因組范圍內(nèi)生成隨機突變，以構(gòu)建大容量突變文庫，通過高通量篩選將正向突變或有利表型挑選出來。此外，還可以設(shè)計選擇壓力，通過適應(yīng)性進化對底盤細(xì)胞進行優(yōu)化[54-55]。

3.3 模塊和底盤細(xì)胞的適配

這一環(huán)節(jié)包括元件強度調(diào)節(jié)、模塊強度調(diào)節(jié)以及網(wǎng)絡(luò)模塊調(diào)控。在上述底盤菌株的構(gòu)建和優(yōu)化過程中，有針對性地阻斷、削弱或強化底盤菌株某些代謝通路，或引入異源模塊，往往會打破菌株內(nèi)部原始的動態(tài)平衡，加重宿主細(xì)胞負(fù)擔(dān)，甚至產(chǎn)生具有生理毒性的代謝產(chǎn)物[56-58]。這些因素都嚴(yán)重制約了菌體的正常生長或延長生長延滯期[59]。而底盤細(xì)胞性能的最優(yōu)往往取決于各模塊間以及模塊與底盤細(xì)胞之間的配合。這需要一方面引入邏輯模塊和調(diào)控模塊，即通過引入由感受蛋白和調(diào)控蛋白組成的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)[59]，或構(gòu)建基因回路[60]，來感知環(huán)境變化（例如終產(chǎn)物的合成以及中間體的消耗速率），調(diào)整代謝路徑中各基因的表達強度[60-61]，達到動態(tài)調(diào)節(jié)代謝流的目的[57, 59]。另一方面，還可以通過調(diào)整各元件、模塊的強度，來實現(xiàn)模塊與底盤的適配。例如，調(diào)節(jié)啟動子強度和起始轉(zhuǎn)錄模式、調(diào)整核糖體結(jié)合位點序列和非編碼基因序列、改良限速酶催化活性和特異性、通過核糖體和δ位點多位點整合提高模塊拷貝數(shù)和調(diào)整模塊表達強度等[18, 35, 43]。此外，各元件、模塊間的組合設(shè)計也可實現(xiàn)不同模塊間的耦合和表達的精細(xì)調(diào)控[52, 62]。

4 化學(xué)品綠色制造未來發(fā)展方向

目前以生物轉(zhuǎn)化為核心的化學(xué)品綠色制造在整個化學(xué)品制造中所占的比重很小[14]。為促進化學(xué)品綠色制造的飛速發(fā)展，提高綠色制造產(chǎn)品市場占有率，建立“高效、清潔、低碳、循環(huán)”的制造模式，建議研究者應(yīng)重點圍繞“原料、轉(zhuǎn)化過程和底盤細(xì)胞”這3個方面，實現(xiàn)以下技術(shù)瓶頸的突破（圖4）。

4.1 以經(jīng)濟、環(huán)保、高效為導(dǎo)向，開發(fā)新型原料與預(yù)處理工藝

第一代以淀粉為碳源的生物制造存在著影響糧食供應(yīng)安全以及高成本等缺點，尋找更為廉價和易得的原料才能最大限度地提升生物制造的優(yōu)勢。為實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略目標(biāo)，提高原料的利用效率，降低制造工業(yè)對環(huán)境的影響，研究者應(yīng)著重發(fā)展新型清潔碳源，即通過生物學(xué)途徑將稀糖液、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及廢棄物等原料轉(zhuǎn)化為可被底盤細(xì)胞利用的單糖或合成路徑中間體。如農(nóng)作物秸稈，我國每年的農(nóng)作物秸稈的理論資源量在8億噸以上，這是一個有待開發(fā)的巨大資源庫。同時也要注重利用C1化合物的發(fā)酵研究，增強人們對相關(guān)宿主系統(tǒng)以及反應(yīng)過程的認(rèn)識，以提高以C1化合物為原料的化學(xué)品生物制造的經(jīng)濟效率。國際上ICI、INEOS Bio、LanzaTech、Newlight Technologies等公司已經(jīng)在如何利用C1資源方面做了大量富有成效的工作[14, 18]。此外，研究者還應(yīng)發(fā)展以金屬、硅為核心的非碳基原料的利用[14]。

4.2 優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化過程，提高生產(chǎn)規(guī)模和經(jīng)濟效益

生物制造大都采用以“有氧、分批、純菌”為特點的發(fā)酵體系。近些年來為提高產(chǎn)量或轉(zhuǎn)化率，研究者的目光都集中于生產(chǎn)菌株的改造方面，而忽視對發(fā)酵所用設(shè)備、工藝的優(yōu)化。而這一方面恰巧就是阻礙生物制造在工業(yè)領(lǐng)域被大規(guī)模應(yīng)用的主要原因之一。因此，研究者要注重對傳質(zhì)和傳熱、產(chǎn)品連續(xù)分離和水循環(huán)利用等相關(guān)裝置和生產(chǎn)過程的開發(fā)，著重對無細(xì)胞反應(yīng)體系和混菌生產(chǎn)體系（多菌種共培養(yǎng)、底物共利用、產(chǎn)物共合成）進行研究。同時還應(yīng)研發(fā)基于小規(guī)模反應(yīng)的生產(chǎn)規(guī)模放大預(yù)測計算工具，以加速化學(xué)品生物制造的實際投產(chǎn)過程。

4.3 底盤細(xì)胞的智能化制造

底盤細(xì)胞是整個化學(xué)品綠色制造鏈條的核心。人工合成生物體系在從生物模塊到系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的各個層次上，采取“設(shè)計--構(gòu)建--檢測--再設(shè)計”的循環(huán)構(gòu)建方式[18, 35, 43]。其中設(shè)計是整個過程的基礎(chǔ)。對底盤細(xì)胞的設(shè)計包括對合成路徑的設(shè)計、對元件和模塊的設(shè)計、對DNA組裝方法的設(shè)計以及對底盤優(yōu)化策略的設(shè)計[35, 61]。針對每一個環(huán)節(jié)都應(yīng)開發(fā)相應(yīng)的計算機輔助設(shè)計工具。其中還應(yīng)著重開發(fā)酶定向進化相關(guān)的分析預(yù)測工具，以提高現(xiàn)有反應(yīng)酶類的催化活性和特異性，創(chuàng)造可催化非天然反應(yīng)的蛋白。同時還應(yīng)注重相關(guān)數(shù)據(jù)庫和云計算分析平臺的開發(fā)。實際上，計算機輔助設(shè)計不僅局限于對底盤細(xì)胞的設(shè)計，它還包涵對細(xì)胞個體到生物反應(yīng)系統(tǒng)再到生物反應(yīng)器的各個水平的設(shè)計，形成整個生產(chǎn)工藝流程標(biāo)準(zhǔn)化集成設(shè)計鏈條。

圖4 化學(xué)品先進制造未來發(fā)展方向Fig. 4 Future direction of chemicals advanced manufacturing

快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)是評估所構(gòu)建的合成路徑及底盤細(xì)胞的有效手段。這里需要對底盤細(xì)胞從基因、蛋白、代謝3個水平進行監(jiān)測。易于操作、低成本、高效率、高精度、高通量、體內(nèi)實時監(jiān)測是檢測技術(shù)的發(fā)展方向。而構(gòu)建這一環(huán)節(jié)包括合成路徑的構(gòu)建和底盤細(xì)胞的優(yōu)化。一方面，需要降低基因合成與大片段拼接組裝的成本，提高工作效率。建立自動化生物制造平臺是有效的解決方案之一。該平臺首先由計算機系統(tǒng)對人工生物系統(tǒng)及其構(gòu)建方法進行設(shè)計，再交由機器人進行構(gòu)建和發(fā)酵生產(chǎn)，最后由高通量分析儀器對制造過程和目標(biāo)產(chǎn)物進行分析[61]。另一方面，還需要擴大可操作底盤細(xì)胞的物種范圍，尤其對在原料利用和特殊產(chǎn)品生產(chǎn)中具有明顯優(yōu)勢的宿主菌株進行馴化，有針對性地建立遺傳操作體系，開發(fā)染色體編輯工具。同時還要圍繞增強底盤細(xì)胞魯棒性展開研究，以利于實際生產(chǎn)規(guī)模的放大。

References

[1] KEASLING J D. Synthetic biology for synthetic chemistry [J]. ACS Chem. Biol., 2008, 3: 64-76.

[2] KHALIL A S, COLLINS J J. Synthetic biology: applications come of age [J]. Nat. Rev. Genet., 2010, 11: 367-379.

[3] FORSTER A C, LEE S Y. Editorial: NextGen SynBio has arrived [J]. Biotechnol. J., 2012, 7: 872.

[4] PRINDLE A. Synthetic biology at all scales [J]. Trends Biotechnol., 2013, 31: 607-608.

[5] WANG Y H, WEI K Y, SMOLKE C D. Synthetic biology: advancing the design of diverse genetic systems [J]. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., 2013, 4: 69-102.

[6] SINGH V. Recent advancements in synthetic biology: current status and challenges [J]. Gene, 2014, 535: 1-11.

[7] AGAPAKIS C M. Designing synthetic biology [J]. ACS Synth. Biol., 2014, 3: 121-128.

[8] CHAO R, YUAN Y, ZHAO H. Recent advances in DNA assembly technologies [J]. FEMS Yeast Res., 2014, doi: 10.1111/1567-1364. 12171.

[9] SHETTY R P, ENDY D, KNIGHT T F Jr. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts [J]. J. Biol. Eng., 2008, 2: 5.

[10] Registry of standard biological parts[EB/OL]. [2014]. http: //www.webcitation.org/6O8Ha2b2B.

[11] HAYDEN E C. Synthetic-biology firms shift focus [J]. Nature, 2014,505: 598.

[12] U.S. Department of Defense. DOD science & technology priorities [EB/OL]. [2014]. http: //community.apan.org/afosr/m/alea_stewart/ 135113/download.aspx.

[13] U.S. Department of Energy. Synthetic biology, report to congress [EB/OL]. [2013]. http: //www.synberc.org/sites/default/files/DOE% 20Synthetic%20Biology%20Report%20to%20Congress_Fnl.pdf.

[14] U.S. National Academy of Sciences. Industrialization of biology: a roadmap to accelerate the advanced manufacturing of chemicals [EB/OL]. [2015]. http://www.nap.edu/catalog/19001.

[15] The McKinsey Global Institute. Disruptive technologies: advances that will transform life, business, and the global economy[EB/OL]. [2013]. http: //www.mckinsey.com/insights/business_technology/ disruptive_technologies.

[16] UK. Department for Business, Innovation & Skills. Eight great technologies: infographics [EB/OL]. [2013]. https: //www.gov.uk/ government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/249268/syn thetic_biology_infographic.pdf.

[17] NIELSEN J, FUSSENEGGER M, KEASLING J, et al. Engineering synergy in biotechnology [J]. Nat. Chem. Biol., 2014, 10: 319-322.

[18] JULLESSON D, DAVID F, PFLEGER B, et al. Impact of synthetic biology and metabolic engineering on industrial production of fine chemicals [J]. Biotechnol. Adv., 2015, doi: 10.1016/j.biotechadv. 2015.02.011.

[19] WEI N, OH E J, MILLION G, et al. Simultaneous utilization of cellobiose, xylose, and acetic acid from Lignocellulosic biomass for biofuel production by an engineered yeast platform [J]. ACS Synth. Biol., 2015, 4: 707-713.

[20] EITEMAN M A, LEE S A, ALTMAN E. A co-fermentation strategy to consume sugar mixtures effectively [J]. J. Biol. Eng., 2008, 2: 3.

[21] MIRA N P, PALMA M, GUERREIRO J F, et al. Genome-wide identification of Saccharomyces cerevisiae genes required for tolerance to acetic acid [J]. Microb. Cell Fact., 2010, 9: 79.

[22] KNOTHE G. Biodiesel and renewable diesel: a comparison progress in energy and combustion [J]. Science, 2010, 36: 364-373.

[23] HOOK S E, WRIGHT A D, MCBRIDE B W. Methanogens: methane producers of the rumen and mitigation strategies [J]. Archaea, 2010, 2010: 945785.

[24] GOYAL N, WIDIASTUTI H, KARIMI I A, et al. A genome-scale metabolic model of Methanococcus maripaludis S2 for CO2capture and conversion to methane [J]. Mol. Biosyst., 2014, 10: 1043-1054.

[25] BOWMAN J P, SLY L I, STACKEBRANDT E. The phylogenetic position of the family Methylococcaceae [J]. Int. J. Syst. Bacteriol., 1995, 45: 182-185.

[26] PIEJA A J, ROSTKOWSKI K H, CRIDDLE C S. Distribution and selection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria [J]. Microb. Ecol., 2011, 62: 564-573.

[27] PIEJA A J, SUNDSTROM E R, CRIDDLE C S. Poly-3-hydroxybutyrate metabolism in the type II methanotroph Methylocystis parvus OBBP [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77: 6012-6019.

[28] PIEJA A J, SUNDSTROM E R, CRIDDLE C S. Cyclic alternating methane and nitrogen limitation increases PHB production in a methanotrophic community [J]. Bioresour. Technol., 2012, 107: 385-392.

[29] XIONG M, SCHNEIDERMAN D K, BATES F S, et al. Scalable production of mechanically tunable block polymers from sugar [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2014, 111: 8357-8362.

[30] YAO Y F, WANG C S, QIAO J, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for production of salvianic acid A via an artificial biosynthetic pathway [J]. Metab. Eng., 2013, 19: 79-87.

[31] INSOMPHUN C, XIE H, MIFUNE J, et al. Improved artificial pathway for biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) with high C6-monomer composition from fructose in Ralstonia eutropha [J]. Metab. Eng., 2015, 27: 38-45.

[32] AJIKUMAR, P K., XIAO W H, TYO K E, et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli [J]. Science, 2010, 330: 70-74.

[33] LEONARD E, AJIKUMAR P K, THAYER K, et al. Combining metabolic and protein engineering of a terpenoid biosynthetic pathway for overproduction and selectivity control [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2010, 107: 13654-13659.

[34] SZCZEBARA F M, CHANDELIER C, VILLERET C, et al. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast [J]. Nat. Biotechnol., 2003, 21: 143-149.

[35] BREITLING R, TAKANO E. Synthetic biology advances for pharmaceutical production [J]. Curr. Opin. Biotechnol., 2015, 35C: 46-51.

[36] CARTER O A, PETERS R J, CROTEAU R. Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli [J]. Phytochemistry, 2003, 64: 425-433.

[37] CHANG M C, EACHUS R A, TRIEU W, et al. Engineering Escherichia coli for production of functionalized terpenoids using plant P450s [J]. Nat. Chem. Biol., 2007, 3: 274-277.

[38] PADDON C J, KEASLING J D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development [J]. Nat. Rev. Microbiol., 2014, 12: 355-367.

[39] HONG K K, NIELSEN J. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae: a key cell factory platform for future biorefineries [J]. Cell Mol. Life Sci., 2012, 69: 2671-2690.

[40] CASPETA L, CHEN Y, GHIACI P, et al. Biofuels. Altered sterol composition renders yeast thermotolerant [J]. Science, 2014, 346: 75-78.

[41] SHONG J, DIAZ M R, COLLINS C H. Towards synthetic microbial consortia for bioprocessing [J]. Curr. Opin. Biotechnol., 2012, 23: 798-802.

[42] ZHOU K, QIAO K, EDGAR S, et al. Distributing a metabolic pathway among a microbial consortium enhances production of natural products [J]. Nat. Biotechnol., 2015, 33: 377-383.

[43] LUO Y, LI B Z, LIU D, et al. Engineered biosynthesis of natural products in heterologous hosts [J]. Chem. Soc. Rev., 2015, doi: 10.1039/c5cs00025d.

[44] FAN L H, ZHANG Z J, YU X Y, et al. Self-surface assembly of cellulosomes with two miniscaffoldins on Saccharomyces cerevisiae for cellulosic ethanol production [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2012, 109: 13260-13265.

[45] QI H, LI B Z, ZHANG W Q, et al. Modularization of genetic elements promotes synthetic metabolic engineering [J]. Biotechnol. Adv., 2015, doi: 10.1016/j.biotechadv.2015.04.002.

[46] ELLIS T, ADIE T, BALDWIN G S. DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond [J]. Integr. Biol. (Camb), 2011, 3: 109-118.

[47] ZHOU Y J, GAO W, RONG Q, et al. Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production [J]. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134: 3234-3241.

[48] DUEBER J E, WU G C, MALMIRCHEGINI G R, et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux [J]. Nat. Biotechnol., 2009, 27: 753-759.

[49] JIANG W, BIKARD D, COX D, et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems [J]. Nat. Biotechnol., 2013, 31: 233-239.

[50] BAO Z, XIAO H, LIANG J, et al. Homology-Integrated CRISPR-Cas (HI-CRISPR) system for one-step multigene disruption in Saccharomyces cerevisiae [J]. ACS Synth. Biol., 2015, 4: 585-594.

[51] SANDER J D, JOUNG J K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes [J]. Nat. Biotechnol., 2014, 32: 347-355.

[52] WANG H H, ISAACS F J, CARR P A, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution [J]. Nature, 2009, 460: 894-898.

[53] DAVID F, SIEWERS V. Advances in yeast genome engineering [J]. FEMS Yeast Res., 2014, doi: 10.1111/1567-1364.12200.

[54] DRAGOSITS M, MATTANOVICH D. Adaptive laboratory evolution—principles and applications for biotechnology [J]. Microb. Cell. Fact., 2013, 12: 64.

[55] PORTNOY V A, BEZDAN D, ZENGLER K. Adaptive laboratory evolution--harnessing the power of biology for metabolic engineering [J]. Curr. Opin. Biotechnol., 2011, 22: 590-594.

[56] REYES L H, GOMEZ J M, KAO K C. Improving carotenoids production in yeast via adaptive laboratory evolution [J]. Metab. Eng., 2014, 21: 26-33.

[57] DAHL R H, ZHANG F, ALONSO-GUTIERREZ J, et al. Engineering dynamic pathway regulation using stress-response promoters [J]. Nat. Biotechnol., 2013, 31: 1039-1046.

[58] KEASLING J D. Manufacturing molecules through metabolic engineering [J]. Science, 2010, 330: 1355-1358.

[59] ZHANG F, CAROTHERS J M, KEASLING J D. Design of a dynamic sensor-regulator system for production of chemicals and fuels derived from fatty acids [J]. Nat. Biotechnol., 2013, 30: 354-359.

[60] HOLTZ W J, KEASLING J D. Engineering static and dynamic control of synthetic pathways [J]. Cell, 2010, 140: 19-23.

[61] CHAO R, YUAN Y, ZHAO H. Building biological foundries for next-generation synthetic biology [J]. Sci. China. Life Sci., 2015, doi: 10.1007/s11427-015-4866-8.

[62] YUAN L Z, ROUVIERE P E, LAROSSA R A, et al. Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production in E. coli [J]. Metab. Eng., 2006, 8: 79-90.

Core technology in chemicals green manufacturing: synthetic biology

XIAO Wenhai1, 2, WANG Ying1, 2, YUAN Yingjin1, 2
(1Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), Tianjin University, Tianjin 300072, China;2SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering, Tianjin 300072, China)

Abstract:Synthetic biology is the engineering of biology. Because it breaks the boundary of inanimate chemicals and life matter, and also promotes life science from understanding to creating, the synthetic biology has played a disruptive role in the development of science and technology, leading to great changes in chemical green manufacturing. Synthetic biology, as a core technology in chemical green manufacturing, mainly focuses on the design and optimization from raw materials to chassis and then the whole process. From the raw materials diversity, chemicals production and chassis selection aspects, the key role of synthetic biology in the chemical green manufacturing process, and also systematically elaborated the design and construction of artificial systems were summarized in this paper. In terms of feedstock, host cell and process, three aspects of outlook on how to develop synthetic biology to promote chemicals green manufacturing in the future were also proposed.

Key words:synthetic biology; chemicals manufacturing; bioenergy; pharmaceuticals; feedstock; chassis; bioprocess

中圖分類號：TQ 033

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）01—0119—10

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151033