HPLC法同時測定產(chǎn)靈丸中4種有效成分

王　堅，徐　菁，李　鵬，朱　軍*

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008

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HPLC法同時測定產(chǎn)靈丸中4種有效成分

王堅1,2，徐菁1,2，李鵬1,2，朱軍1,2*

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008

[摘要]目的建立同時測定產(chǎn)靈丸(防風(fēng)、蒼術(shù)、白術(shù)等19味藥物)中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素4種成分的高效液相色譜法。方法色譜柱為依利特C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫；流速為1.3 mL/min；檢測波長：254 nm (升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷)、337 nm (蒼術(shù)素醇、蒼術(shù)素)；柱溫為30 ℃。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素質(zhì)量濃度分別在5.22~104.40 μg/mL (r=0.999 3)、4.95~99.00 μg/mL (r=0.999 7)、4.89~97.80 μg/mL (r=0.999 5)、6.34~126.80 μg/mL (r=0.999 2)時與其峰面積線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為98.79%、97.21%、100.07%、96.90%，RSD (n=6)分別為1.19%、1.13%、0.89%、0.85%。結(jié)論該定量測定方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠并且重現(xiàn)性好，可作為產(chǎn)靈丸中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]產(chǎn)靈丸；升麻素苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷；蒼術(shù)素醇；蒼術(shù)素

0引言

產(chǎn)靈丸由防風(fēng)、蒼術(shù)、白術(shù)、人參、當(dāng)歸、川芎、何首烏(黑豆酒炙)、荊芥穗、麻黃、川烏(銀花甘草炙)、草烏(銀花甘草炙)、白芷、細辛、八角茴香、木香、兩頭尖、桔梗、血竭、甘草(蜜炙) 19味藥物組成，具有益氣養(yǎng)血、散風(fēng)止痛的功效，主要治療產(chǎn)后氣血虛弱、感受風(fēng)寒引起的周身疼痛、頭目眩暈、惡心嘔吐、四肢浮腫等疾病[1-2]。防風(fēng)、蒼術(shù)、白術(shù)為方中的主要藥物，原標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑第十冊)僅對方中麻黃所含的鹽酸麻黃堿進行了定性鑒別研究，未對該制劑處方中任何組分進行定量研究，產(chǎn)靈丸中有效成分的定量研究目前也未見報道，而僅一味藥的定性并不能有效控制該方質(zhì)量的一致性和產(chǎn)品的療效，本試驗采用高效液相梯度洗脫法對產(chǎn)靈丸中主藥防風(fēng)所含升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和蒼術(shù)、白術(shù)所含蒼術(shù)素醇、蒼術(shù)素開展同時定量方法學(xué)研究，為改進產(chǎn)靈丸的制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可行性方法。

1儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1200型HPLC色譜儀(美國安捷倫公司)；SY-360型實驗室超聲波提取器(上海寧商超聲儀器有限公司)。

1.2試藥升麻素苷對照品(批號：111522-201310，含量以95.0%計，常溫干燥、遮光密閉保存)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號：111523-201208，含量以96.4%計，室溫保存)、蒼術(shù)素(批號：111924-201404，含量以99.7%計，冷凍、遮光)均購于中國食品藥品檢定研究院；蒼術(shù)素醇(批號：61642-89-5，純度：98.0%)購于上海士鋒生物科技有限公司；產(chǎn)靈丸(規(guī)格：每100粒重21 g；批號：13022088、13091062、14021007)購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；甲醇、乙腈均采用色譜純，采購于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：采用依利特C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈作為流動相A相，水作為流動相B相，按照比例進行梯度洗脫，具體梯度洗脫程序見表1[3-8]；檢測波長(0~24 min，λ1=254 nm[9-11]，24~44 min，λ2=337 nm[12])；柱溫為30 ℃；進樣量20 μL。在以上色譜條件下，待測成分峰與相鄰峰之間的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按5-O-甲基維斯阿米醇苷計不得低于3 000。

表1　流動相梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備取對照品升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素適量，精密稱定，分別用甲醇進行溶解并定容，制成升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素質(zhì)量濃度分別為0.522、0.495、0.489、0.634 mg/mL的4種對照品儲備液。依次分別精密吸取上述各儲備液2.5、2.0、5.0、7.5 mL置于同一個50 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制成升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇與蒼術(shù)素質(zhì)量濃度分別為0.026 1、0.019 8、0.048 9、0.095 1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備隨機取產(chǎn)靈丸10 g，剪碎，取5.0 g左右，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入精密量取甲醇50 mL，稱定總重量并記錄具體數(shù)據(jù)，超聲處理60 min，放置室溫，再稱定其總重量并記錄具體數(shù)據(jù)，缺失的部分以甲醇補充至原重量，搖勻，用0.45 μm濾頭過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備嚴(yán)格按照產(chǎn)靈丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方和制備工藝，分別稱取除防風(fēng)的其余藥味、除蒼術(shù)和白術(shù)的其余藥味各1份，并分別制備與產(chǎn)靈丸工藝一致的防風(fēng)空白樣品和蒼術(shù)白術(shù)空白樣品?？瞻讟悠吠?.2.2”項方法，分別制成防風(fēng)空白溶液和蒼術(shù)白術(shù)空白溶液。

2.3專屬性實驗分別精密吸取上述供試品溶液、混合對照品溶液、防風(fēng)空白溶液和蒼術(shù)白術(shù)空白溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果表明，產(chǎn)靈丸中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素對照品與其他組分均能達到基線分離，同時供試品溶液色譜圖與對照品相應(yīng)位置處有吸收峰，而空白溶液色譜圖在對照品相應(yīng)位置處無吸收峰，色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系考察精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，搖勻，配成系列濃度的混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，通過圖譜獲得各對照品相應(yīng)峰面積A，并根據(jù)各對照品質(zhì)量濃度C，得回歸方程分別為：升麻素苷A=3.025 4×105C-195.7，r=0.999 3，線性范圍5.22~104.40 μg/mL；5-O-甲基維斯阿米醇苷A=2.961 7×105C+306.5，r=0.999 7，線性范圍4.95~99.00 μg/mL；蒼術(shù)素醇A=7.040 9×105C+513.6，r=0.999 5，線性范圍4.89~97.80 μg/mL；蒼術(shù)素A=1.021 8×106C+584.2，r=0.999 2，線性范圍6.34~126.80 μg/mL。結(jié)果表明，在相應(yīng)的線性范圍，4種成分的質(zhì)量濃度與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.5進樣精密度試驗精密吸取混合對照品溶液(升麻素苷0.026 1 mg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.019 8 mg/mL、蒼術(shù)素醇0.048 9 mg/mL、蒼術(shù)素0.095 1 mg/mL) 20 μL，連續(xù)進樣6次，分別測得4種成分的峰面積，計算各成分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素的RSD分別為1.39%、0.84%、1.62%、0.57%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性考察稱取適量同一批號的產(chǎn)靈丸作為供試品，分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算峰面積，通過線性方程獲得各成分含量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素的RSD分別為1.27%、0.95%、1.42%和0.69%。

圖1　升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素的HPLC色譜圖

2.7供試品溶液的穩(wěn)定性考察取同一批號的產(chǎn)靈丸制備的供試品溶液，將其分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進行測定，每次進樣量為20 μL，測定相應(yīng)的峰面積值，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素的RSD分別為0.96%、1.08%、1.53%、0.44%，表明24 h內(nèi)產(chǎn)靈丸供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.8加樣回收率試驗稱取已知質(zhì)量的產(chǎn)靈丸(升麻素苷為0.279 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇苷為0.208 mg/g、蒼術(shù)素醇為0.502 mg/g、蒼術(shù)素為0.947 mg/g) 5 g，剪碎，取2.5 g左右，精密稱定，置于50 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液25 mL、甲醇溶液25 mL，精密稱定并記錄具體數(shù)據(jù)，超聲處理60 min，放置室溫，再精密稱定并記錄具體數(shù)據(jù)，重量缺失部分以甲醇補充至原重量，搖勻，用0.45 μm濾頭過濾，取續(xù)濾液，作為加樣供試品試液。按“2.1”項下色譜條件測定，分別計算所測各組分回收率、平均回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2　升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素回收率試驗

2.9樣品測定取3個不同批號的產(chǎn)靈丸樣品，按“2.2.2”項法、按“2.1”項色譜條件測定4種成分含量，結(jié)果見表3。

表3　含量測定結(jié)果(mg/g)

3討論

3.1指標(biāo)成分的確定蒼術(shù)和防風(fēng)是產(chǎn)靈丸方中的主要藥物，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷是防風(fēng)藥材中的主要成分，屬于色原酮類化合物，2010版藥典將升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷作為防風(fēng)藥材的指標(biāo)成分；蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素為蒼術(shù)藥材中的主要成分，同時方中白術(shù)也含有蒼術(shù)素，本文采用高效液相梯度洗脫法對產(chǎn)靈丸中4種成分進行定量研究，利于確保該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

3.2流動相的選擇在流動相的選擇中，筆者還曾考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸溶液[6]、甲醇-水[9-11]、乙腈-水[3-5,7-8]為流動相梯度洗脫，結(jié)果以乙腈-0.3%磷酸溶液梯度洗脫時，蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素與其他峰分離效果較好，但升麻素苷峰型不對稱；以甲醇-水為流動相梯度洗脫，蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)素達不到基線分離，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重；以乙腈-水為流動相梯度洗脫時，所測各組分峰型良好，各組分均能達到基線分離，分離度均>1.5。

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Simultaneous determination of prim-O-glucosylcimifugin,5-O-methylvisammioside,atractylodinol and atractylodin in chanling pill by HPLCWANG Jian1,2,XU Jing1,2,LI Peng1,2,ZHU Jun1,2*(1.Department of Pharmacy,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei Medical University,Shiyan 442008,China;2.Institute of Pharmaceutical Analysis and Drug Screening,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of prim-O-glucosylcimifugin,5-O-methylvisammioside,atractylodinol and atractylodin in chanling pill.MethodsThe Hypersil C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used. The mobile phase was composed of acetonitrile-water at the flow rate of 1.3 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm for prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methylvisammioside,337 nm for atractylodinol and atractylodin. The column temperature was 30 ℃.ResultsPrim-O-glucosylcimifugin,5-O-methylvisammioside,atractylodinol and atractylodin had good linearity at 5.22~104.40 μg/mL (r=0.999 3),4.95~99.00 μg/mL (r=0.999 7),4.89~97.80 μg/mL (r=0.999 5),6.34~126.80 μg/mL (r=0.999 2) respectively. The average recoveries andRSDwere 98.79% (1.19%),97.21% (1.13%),100.07% (0.89%) and 96.90% (0.85%) respectively.ConclusionThe method is simple,accurate and reliable,it can be used for the quality control of chanling pill.

Key words：Chanling pill;Prim-O-glucosylcimifugin;5-O-methylvisammioside;Atractylodinol;Atractylodin

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601019

*通信作者

收稿日期：2015-04-17