丹參酮ⅡA磺酸鈉治療先天性人巨細(xì)胞病毒性肝炎小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

雷尚芳，白　娜，鮑升娟，雷尚林

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)感染科，湖北 十堰 442000;2.湖北省十堰市張灣區(qū)花果醫(yī)院，湖北 十堰 442000;3.湖北省十堰市張灣區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督局，湖北 十堰 442000

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丹參酮ⅡA磺酸鈉治療先天性人巨細(xì)胞病毒性肝炎小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

雷尚芳1，白娜1，鮑升娟2，雷尚林3*

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)感染科，湖北 十堰 442000;2.湖北省十堰市張灣區(qū)花果醫(yī)院，湖北 十堰 442000;3.湖北省十堰市張灣區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督局，湖北 十堰 442000

[摘要]目的建立小鼠先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎動(dòng)物模型，研究丹參酮ⅡA磺酸鈉的治療機(jī)制，為治療人類感染先天性巨細(xì)胞病毒肝炎的合理用藥提供理論依據(jù)。方法Balb/c小鼠80只(雌雄各半)，配對(duì)后隨機(jī)分對(duì)照組、病毒感染組、丹參酮大劑量組、丹參酮小劑量組，丹參酮大、小劑量組經(jīng)腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉1、0.5 mg/(10 g·d)，對(duì)照組、病毒感染組注射等體積細(xì)胞維持液DMEM，四組均治療21 d。放射免疫法檢測(cè)治療前后小鼠血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)：層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型膠原(cⅣ)、透明質(zhì)酸(HA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，小鼠肝功能：總膽紅素(STB)、膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶：CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9活性。結(jié)果經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉治療21 d后，丹參酮大小劑量組LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1、STB、TBA、ALT、GGT、AST及CYP2E1、CYP3A4酶活性均有不同程度降低，與病毒感染組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，丹參酮大、小劑量組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)小鼠接種人巨細(xì)胞病毒性肝炎有明確的治療作用，機(jī)制與其活血化瘀、降低TGF-β1、抑制小鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶酶活性，促進(jìn)肝功能恢復(fù)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]丹參酮ⅡA磺酸鈉；先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎動(dòng)物模型；肝功能；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；細(xì)胞色素P450亞型酶

0引言

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)常感染肝臟、神經(jīng)及血液系統(tǒng)，為雙鏈線狀DNA病毒，該病毒屬皰疹病毒科，主要生物學(xué)特征為同期性潛伏-活動(dòng)[1]。機(jī)體感染先天性人巨細(xì)胞病毒后，可出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能損傷，主要癥狀包括肝脾腫大，病理性黃疸、高膽紅素血癥，并最終發(fā)展為肝硬化、肝衰竭而死亡[2]。近年來(lái)臨床使用丹參酮ⅡA磺酸鈉防治人巨細(xì)胞病毒取得肯定的臨床效果，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制探討有限。本研究建立小鼠先天性巨細(xì)胞病毒肝炎動(dòng)物模型，深入觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉治療小鼠先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎的效果，探討藥物保肝護(hù)肝作用機(jī)制，為其臨床治療CMV提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器及試劑Waters 2010型高效液相色譜儀(迪馬公司)；丹參酮ⅡA磺酸鈉(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20026866)。HCMV-AD169病毒，6.0 logTCID50/mL的病毒作為實(shí)驗(yàn)用毒種[3]。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇發(fā)情期SPF級(jí)Balb/c小鼠80只(雌雄各半)，10～12周齡，體重(25±5)g，動(dòng)物由十堰市太和醫(yī)院科研所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2011-0031；許可證：SCXK(湘)2011-0003。動(dòng)物福利：飼養(yǎng)環(huán)境要求動(dòng)物房恒溫(22 ℃，濕度1/2～75%)，單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照；飼養(yǎng)要求滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理[4]，小鼠自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，觀察動(dòng)物飲水進(jìn)食情況，稱體重，及時(shí)清理糞便。

1.3小鼠先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎動(dòng)物模型參照鄭意等[5]小鼠先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎動(dòng)物模型方法，小鼠按隨機(jī)原則分為對(duì)照組、病毒感染組、丹參酮小劑量組、丹參酮大劑量組，每組20只(雌雄比為1∶1)，四組小鼠分組后再采用自由配對(duì)(10對(duì))，每對(duì)雌雄鼠各1只，病毒感染組及丹參酮組分別于腹腔內(nèi)接種HCMV-AD169病毒株病毒懸液1.0 mL/(6.0 logTCID50/mL)，對(duì)照組腹腔注射細(xì)胞維持液DMEM 1.0 mL/只。接種后配對(duì)飼養(yǎng)，觀察小鼠受精并記錄受精時(shí)間，待所生新生小鼠出生后第10天開始治療，治療前選擇每對(duì)小鼠生產(chǎn)的新生小鼠1只(共10只)。丹參酮小劑量組按0.5 mg/(10 g·d)、丹參酮大劑量組按1 mg/(10 g·d)經(jīng)腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉治療21 d，對(duì)照組及病毒感染組注射等體積細(xì)胞維持液DMEM。

1.4檢測(cè)指標(biāo)參照文獻(xiàn)[6]，經(jīng)小鼠眶靜脈取血0.5 mL置于肝素管，生化檢測(cè)肝功能TBA、GGT、ALT、AST、STB。小鼠斷頭取肝，用GR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)差速離心法制備小鼠肝微粒體。先按1∶4加入勻漿緩沖液(11.5 g/L氯化鉀，50 mmol/L~Tris，pH：7.4)勻漿，4 ℃下10 000轉(zhuǎn)離心60 min，將離心管中沉淀組織重懸于0.25 mol/L蔗糖溶液中即獲得肝微粒體，分別將各組小鼠肝微粒體標(biāo)本置于-80 ℃冰箱暫存，檢測(cè)時(shí)用SHA-C水浴恒溫振蕩器37 ℃先孵育并振蕩30 min，再離心20 min后取上清液，用Waters 2010型高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)各組小鼠細(xì)胞色素P450亞型酶(CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)酶活性。

2結(jié)果

2.1四組小鼠LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1比較病毒感染組LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明小鼠均感染人巨細(xì)胞病毒，HCMV已垂直傳播給子代小鼠。丹參酮組LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1明顯降低，與病毒感染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而丹參酮大、小劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1　四組小鼠LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1比較

2.2丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)肝功能的影響病毒感染組TBA、GGT、ALT、AST、STB均明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)21 d治療，病毒感染組TBA、GGT、ALT、AST、STB仍然保持在較高水平，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。丹參酮組TBA、GGT、ALT、AST、STB明顯降低，與病毒感染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而丹參酮大、小劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2　四組小鼠肝功能TBA、GGT、ALT、AST、STB比較

2.3丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)細(xì)胞色素P450亞型酶活

性的影響對(duì)照組治療前后細(xì)胞色素P450亞型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)酶活性保持正常水平；病毒感染組細(xì)胞色素P450亞型酶表達(dá)均增強(qiáng)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參酮大、小劑量CYP2E1、CYP3A4明顯降低，與病毒感染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CYPIA2、CYP2D6、CYP2C9無(wú)明顯變化，且丹參酮大、小劑量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)細(xì)胞色素P450亞型酶酶活性的影響(nmol/mL)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與病毒感染組比較，#P<0.05

3討論

丹參酮ⅡA磺酸鈉(Sodium tanshinone ⅡAsulfonate，STS)是從中草藥丹參中純化分離出二萜醌類化合物，提取后經(jīng)化學(xué)方法磺化而成的注射液，富含丹參酚酸、丹參酮甲酯、丹參酮ⅡA等主要有效藥理成分[7]?！秴瞧毡静荨酚涊d丹參“味辛性涼、治心肌腹痛”[8]。具有“活血通經(jīng)、涼血消癰之功效”[9]。人巨細(xì)胞病毒感染機(jī)體后主要破壞肝臟組織，造成肝臟炎性改變，導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹變性、壞死，促使肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活、增殖與轉(zhuǎn)化，并最終導(dǎo)致肝纖維化[10]，實(shí)驗(yàn)室檢查血清肝纖維化血清學(xué)及肝功能指標(biāo)常升高。由于臨床藥物治療時(shí)，90%的藥物由細(xì)胞色素P450亞型酶代謝，且P450的抑制與誘導(dǎo)均影響藥物的療效，P450活性增強(qiáng)常導(dǎo)致藥物的治療作用降低，過(guò)敏等不良反應(yīng)增多[11]。LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1及TBA、GGT、ALT、AST、STB等可客觀反映肝臟炎性改變及肝功能，因此，我們采用以上各指標(biāo)評(píng)價(jià)丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)小鼠先天性人巨細(xì)胞病毒肝炎的治療作用。

感染人巨細(xì)胞病毒小鼠在用丹參酮ⅡA磺酸鈉治療21 d后，肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1，肝功能STB、TBA、ALT、GGT、AST，以及CYP2E1、CYP2C9酶活性均有不同程度降低。LN、PC-Ⅲ、cⅣ、HA、TGF-β1等指標(biāo)的下降與丹參酮ⅡA磺酸鈉活血化瘀、增加肝血流量、改善肝臟組織微循環(huán)有關(guān)。有研究證實(shí)，丹參酮ⅡA磺酸鈉能明顯降低肝纖維化大鼠血清NO、MDA，清除機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1mRNA基因表達(dá)而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用[12]。病毒在肝臟增殖時(shí)，由于其對(duì)正常肝細(xì)胞的破壞，Na+-K+-ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙，導(dǎo)致細(xì)胞修復(fù)能力下降。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，從電生理特點(diǎn)分析認(rèn)為，丹參可能通過(guò)增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活性,改善肝臟組織能量代謝而起到保護(hù)作用[13]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA磺酸鈉具有降低細(xì)胞色素P450亞型酶CYP2E1、CYP3A4的作用，由于CYP2E1、CYP3A4與藥物代謝及相互作用密切相關(guān)，其降低有利于藥物的代謝并減少不良反應(yīng)、增加療效。小鼠在感染人巨細(xì)胞病毒后，其肝臟ATP和蛋氨酸腺苷蛋氨酸環(huán)化酶活性降低，Na+-K+-ATP酶泵功能及肝臟細(xì)胞膜流動(dòng)性均下降，直接導(dǎo)致TBA、GGT、ALT、AST、STB升高[14]。在使用丹參酮ⅡA磺酸鈉治療21 d后，TBA、GGT、ALT、AST、STB明顯下降，說(shuō)明其具有促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)小鼠接種人巨細(xì)胞病毒性肝炎有明確的治療作用，機(jī)制包括活血化瘀，減輕血管壁炎癥反應(yīng)，涼血消癰[15]，增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶泵功能，促進(jìn)質(zhì)膜磷脂甲基化，改善微循環(huán)，增加肝臟組織供氧，抑制炎癥反應(yīng)造成的肝損傷而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。

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Experimental study of tanshinone A sulfonic acid sodium in the treatment of congenital cytomegalovirus hepatitis in miceLEI Shang-fang1,BAI Na1,BAO Sheng-juan2,LEI Shang-lin3*(1.Department of Infection of Shiyan Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;2.Huaguo Hospital of Shiyan City,Shiyan 442000,China;3.Health Supervision Bureau in Zhangwan District,Shiyan 442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo research the mechanisms of sodium tanshinone A sulfonate in the treatment of animal model of murine congenital human cytomegalovirus hepatitis and to provide a theoretical basis for the treatment of congenital human cytomegalovirus hepatitis.MethodsEighty Balb/c mice (male and female) were paired and randomly divided into control group,viral infection group,small dose of tanshinone group and high dose of tanshinone group.Mice of tanshinone group were injected sodium tanshinone A sulfonate [0.5 mg/(10 g·d),1 mg/(10 g·d)] through intraperitone,and the mice of control group and infection group were injected DMEM.All the mice were treated for 21 d.The serum serologic indicators of hepatic fibrosis,such as laminin (LN),type Ⅲ procollagen (PC-Ⅲ),type Ⅳ collagen (cⅣ),hyaluronic acid (HA) and transforming growth factor-β1(TGF-β1), were measured before and after treatment by Radioimmunoassay.The indexes of liver function of mice,such as, the content of total bilirubin (STB),bile acid (TBA),alanine aminotransferase (ALT),glutamyl transferase (GGT),aspartate aminotransferase (AST) and the activity of hepatic microsomal cytochrome P450isoforms (CYP2E1,CYP1A2,CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9),were defermined.ResultsThe content of LN,PC-Ⅲ,cⅣ,HA,TGF-β1,STB,TBA,ALT,GGT,AST,and the activity of CYP2E1 and CYP3A4 in sodium tanshinone A sulfonic group were lower than those of viral infection group at 21 d after treatment (P<0.05). There was no significant difference between the two tanshinone groups (P>0.05).ConclusionSodium tanshinone A sulfonate has definite therapeutic effect on mice inoculated with human cytomegalovirus hepatitis,and the mechanism is related to the decreased sodium tanshinone A sulfonate TGF-β1and liver microsomal cytochrome P450isoform enzyme activity.

Key words：Sodium tanshinone A sulfonate;Congenital human cytomegalovirus hepatitis animal model;Liver function;Transforming growth factor-β1;Isoform of cytochrome P450enzyme

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601003

*通信作者

收稿日期：2015-05-06