水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子標記輔助選擇與利用

王　飛,王立廣,潘梅瑤,鈕中一,周　勇,梁國華

(1.揚州大學 農(nóng)學院,江蘇 揚州　225000;2.江蘇武進水稻研究所,江蘇 常州　213000)

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水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子標記輔助選擇與利用

王飛1,王立廣1,潘梅瑤1,鈕中一2,周勇1,梁國華1

(1.揚州大學 農(nóng)學院,江蘇 揚州225000;2.江蘇武進水稻研究所,江蘇 常州213000)

摘要：旨在快速改良武運粳29196的稻瘟病抗性。采用定向回交育種策略,運用分子標記輔助選擇技術和花藥培養(yǎng)技術,快速改良武運粳29196的稻瘟病抗性。以秈稻品種谷梅4號為稻瘟病抗性基因Pigm(t)的供體,以高產(chǎn)易感稻瘟病的品系武運粳29196為受體,在連續(xù)回交和自交過程中,利用與Pigm(t)緊密連鎖的InDels標記S95477和S29742進行分子標記輔助選擇。在BC2F1世代,進行花藥培養(yǎng),獲得185個雙單倍體群體(DH群體),從中篩選出82個含有Pigm(t)基因的改良株系。在經(jīng)過對農(nóng)藝性狀、稻瘟病抗性的系統(tǒng)鑒定與稻米品質性狀測定后,發(fā)現(xiàn)改良株系DH036和DH158的綜合性狀與武運粳29196已十分相近,且稻米品質有所提升,保持了武運粳29196豐產(chǎn)性的同時,稻瘟病抗性有了明顯的提高。利用定向回交、花藥培養(yǎng)和分子標記輔助選擇相結合的技術體系,可明顯提高稻瘟病抗性改良的預見性和準確性,縮短育種年限、加快育種進程。新育成的武運粳29196抗性改良系,為稻瘟病抗性育種提供了重要的遺傳資源。

關鍵詞：水稻;抗稻瘟病基因Pigm(t);分子標記輔助選擇;回交育種;花藥培養(yǎng)

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的,是水稻生產(chǎn)上最具危害性的三大病害之一[1],其遺傳背景十分復雜,生理小種變異也十分迅速,新培育的抗病品種的抗性很難保持[2],再加上環(huán)境氣候變化的影響,使得稻瘟病的危害范圍和程度也越來越重。進入20世紀90年代以來,我國稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬hm2以上,由稻瘟病引起的水稻減產(chǎn)量占總產(chǎn)的10%~30%左右[3],造成全球水稻產(chǎn)量損失達數(shù)億kg,這些糧食足以養(yǎng)活6 000多萬人口[4]。給全球水稻生產(chǎn)量和經(jīng)濟效益發(fā)展帶來了嚴重的損失。所以,如何選育出具有持久抗稻瘟病的水稻新品種,是廣大育種工作者面臨的主要任務之一。

隨著科技水平的發(fā)展,開發(fā)了越來越多的分子標記,其種類和數(shù)量都日益豐富,稻瘟病抗性基因的定位及克隆在此基礎上得到了迅速發(fā)展。稻瘟病抗性基因的精細定位和克隆,是利用抗病基因進行分子標記輔助選擇育種的關鍵工作[5]。如Berruyer等[6]通過抗病品種IR64和易感品種Azucena雜交,經(jīng)花藥培養(yǎng)構建DH群體,結合開發(fā)的SSR標記,將抗稻瘟病基因Pi33定位于第8號染色體的短臂上;Deng等[7]通過抗病品種谷梅4號和易感品質Maratelli雜交,將廣譜抗性基因Pigm(t)定位于水稻第6號染色體上,將其定位在70 kb區(qū)間內(nèi),該抗病基因與Pi2、Pi9緊密連鎖或等位。通過將MAS技術應用于抗稻瘟病育種,可以將優(yōu)勢基因聚合到一起,實現(xiàn)水稻抗稻瘟病的持久性。本研究利用定向回交、花藥培養(yǎng)和分子標記輔助選擇相結合的技術體系,改良了武運粳29196對稻瘟病的抗性水平,為稻瘟病抗性育種提供了重要的遺傳資源。

1材料和方法

1.1供試水稻材料

抗稻瘟病Pigm(t)基因的供體親本為谷梅4號(GM4),為四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所選育的秈型常規(guī)稻。武運粳29196是江蘇(武進)水稻研究所培育的一個優(yōu)良常規(guī)粳稻,株型和產(chǎn)量性狀非常突出,但在稻瘟病高發(fā)地區(qū)表現(xiàn)為高感。本研究以武運粳29196為受體親本,含有Pigm(t)基因的谷梅4號為供體親本,構建BC2F1群體,從中選擇性狀優(yōu)良且攜帶抗病基因Pigm(t)的單株作花藥培養(yǎng)供體材料。2012年構建70個BC1F1株系。2013年構建199個BC2F1株系,2014年構建185個武運粳29196遺傳背景的DH株系。

1.2供試菌株以及接種鑒定

從江蘇省不同生態(tài)地區(qū)分離鑒定的稻瘟病菌中，選擇各個生理小種代表性菌株的混合液作為供試菌株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所及江蘇省里下河農(nóng)業(yè)科學研究所提供。

1.3花藥培養(yǎng)

在2013年7-8月水稻孕穗期時,從BC2F1群體中選擇攜帶抗病基因且性狀優(yōu)良的植株,按照吳丹等[8]提供的方法進行花藥培養(yǎng)。

1.4DNA提取及PCR擴增

在水稻苗期,分別取上述親本材料和各群體單株的新鮮葉片2 cm左右采用小樣CTAB法提取DNA[9]。

PCR 擴增引物采用與稻瘟病抗性基因Pigm(t)緊密連鎖的分子標記S29742和S95477,此標記由何祖華實驗室開發(fā)[7],引物序列為S29742(F):CAGTGAAACGAACGCTATG,S29742(R):AATAGG AAGGGTTGATGTTG;S95477(F):AATTCTTCCACG CCCTAAT,S95477(R):AATAGGAAGGGTTGATGT TG,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR 反應體系為 25 μL,含2 μL DNA模板,2.5 μL 10×Buffer(含Mg2+),2.5 μL dNTP,2 μL 5 pmol/μL 上下游混合引物,0.2 μL rTaqDNA 聚合酶,13.3 μL ddH2O。PCR 反應程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s,52~55 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,34個循環(huán);72 ℃延伸10 min,18 ℃保存[10]。最后PCR擴增產(chǎn)物在溴化乙錠染色的3%瓊脂糖凝膠中用1×TAE緩沖液以 8~12 V/cm的電壓進行電泳,利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析帶型[11]。

1.5田間試驗與農(nóng)藝性狀考種

2013年冬季,將花培苗移栽于海南省陵水縣揚州大學南繁育種基地。于2014年4月收獲花培苗自交種子,5月分別種于揚州市槐泗鎮(zhèn)試驗基地和淮安市洪澤縣江蘇油田農(nóng)工商公司鉆井農(nóng)場。其中,在揚州試驗基地,每個株系種10行,每行10株,武運粳29196也按照同樣的規(guī)格種植作為對照。田間管理按當?shù)刎S產(chǎn)標準,只防蟲不防病。在洪澤縣江蘇油田農(nóng)工商公司鉆井農(nóng)場,每個DH系種植20行,每行10株,武運粳29196作為對照,按同樣的規(guī)格種植。

在水稻孕穗期時,于揚州試驗基地進行人工接種試驗。采用活體穗苞注射接種法:選取稻穗仍未露出但即將破胸的苞穗,用注射器注入1 mL的各菌株混合液,在每個株系上注射5根稻苞[12]。按孫漱沅等[13]于黃熟期調查病情及劃分抗性:0級(HR):無病;1級(R):每穗損失5%以下(個別枝梗發(fā)病);2級(MR):每穗損失20%左右(1/3左右枝梗發(fā)病);3級(MS):每穗損失50%左右(穗頸或主軸發(fā)病,谷粒半癟);4級(S):每穗損失70%左右(穗頸發(fā)病,大部癟谷);5級(HS):每穗損失100%(穗頸發(fā)病,造成白穗)。在江蘇油田農(nóng)工商公司鉆井農(nóng)場種植的群體,進行自然發(fā)病調查,每個株系選取50株統(tǒng)計發(fā)病單株數(shù),重復2次。

在水稻成熟期,于洪澤湖油田農(nóng)場進行農(nóng)藝性狀考種,選取中間一行的中間5株考察其株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒質量、穗長及劍葉長等農(nóng)藝性狀[14]。并且每個株系隨機選取50株進行測產(chǎn),進而測得平均單株產(chǎn)量。

1.6稻米品質性狀測定

以洪澤湖油田農(nóng)場收獲的小區(qū)稻谷為材料,測定出糙率、精米率、整精米率、堊白粒率、堊白度、長寬比等碾磨品質和外觀品質,按農(nóng)業(yè)部部頒標準《優(yōu)質稻谷 GB/T17891~1999》測定糙米率、整精米率、堿消值等理化指標。RVA 譜特征值主要包括最高黏度(Peak viscosity,PKV)、熱漿黏度(Hot pasteviscosity,HPV)、冷漿黏度(Cool paste viscosity,CPV)、崩解值(Breakdown,BDV)、消減值(Setback,SBV)和回復值(Consistence,CSV)等。

2結果與分析

2.1分子標記鑒定結果

分子標記S95477檢測表明,2012年獲得的70個BC1F1株系中有33個含有Pigm(t)基因,在該位點雜合。檢測2013年獲得199個BC2F1株系中有69個含有Pigm(t)基因,在該位點雜合。分子標記S29742檢測表明,2014年獲得的185個武運粳29196遺傳背景的DH株系中有82個含有Pigm(t)基因,且在該位點純和,有1個株系在該位點為雜合,可能是因為播種時人工混雜造成,如圖1。得到的DH株系有44.32%的純合株系含有Pigm(t)(表1)。

A.武運粳29196;B.谷梅4號。

世代Generation總檢測株數(shù)TotalNo.ofplanttested攜帶抗病基因Pigm(t)植株數(shù)No.ofplantwithresistancegenes攜帶抗病基因植株所占比例/%PercentageoftheplantwithresistantgeneWuyunjing29196/GM4BC1F1703347.14Wuyunjing29196/GM4BC2F11996934.67DH(BC2F1)1858244.32

2.2DH系的稻瘟病抗性的鑒定結果

在揚州市槐泗鎮(zhèn)試驗基地進行人工接種稻瘟病菌條件下鑒定稻瘟病抗性,在洪澤縣江蘇油田農(nóng)工商公司鉆井農(nóng)場進行自然誘發(fā)條件下鑒定稻瘟病抗性。結果如表2所示,結合DH株系的株高和孕穗期,從82個含有抗病基因Pigm(t)的株系中篩選出21個DH株系,其穗瘟抗性高于對照系武運粳29196(圖2)。表2的數(shù)據(jù)為平均值。

2.3DH系的農(nóng)藝性狀調查結果

所得21個DH株系農(nóng)藝性狀良好且稻瘟病抗性高,以武運粳29196作為對照,考察和比較DH及對照的孕穗期、株高、穗長、穗粒數(shù)、單株產(chǎn)量、千粒質量及劍葉長等農(nóng)藝性狀。結果表明,DH036、DH158這2個株系在單株產(chǎn)量上略高于對照武運粳29196,穗粒數(shù)低于對照武運粳29196,說明這2個DH株系基本保持了武運粳29196的特性(表3)。

表2　部分DH株系及對照對稻瘟病的抗性表現(xiàn)

圖2　兩個改良系(DH)及對照(CK)的抗病表現(xiàn)

株系Line穗數(shù)PNP千粒質量/gGW穗粒數(shù)GNP單株產(chǎn)量/gYP株高/cmPH穗長/cmPL劍葉長/cmSWLDH03611.624.38194.3**40.34*92.9*17.822.3DH15811.425.01178.0**36.65108.217.924.0CK10.023.59230.436.16105.418.725.3

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著。

Note:*and**indicate significant difference at the 0.05 and 0.01probability levels,respectively.

2.4DH系的稻米品質性狀檢測結果

表4中列出了2個DH株系及對照武運粳29196的碾磨品質、外觀品質和RVA譜特征值。各改良系的出糙率、精米率均無顯著差異;2個改良系的整精米率都極顯著高于武運粳29196;DH158的米粒長寬比高于對照武運粳29196,偏長粒(圖3)。RVA譜特征值尤其是回復值、消減值和崩解值能夠較好地反映水稻品質間蒸煮食味品質的差異[15],隋炯明等[16]研究認為,RVA譜特征值中崩解值高,消減值、回復值低的品種類型,其米飯軟而黏、有彈性、適口性好;而崩解值低,消減值、回復值高的品種類型,米飯硬而黏性小,適口性差。從表4中的RVA譜特征值來看,DH158這個改良系的崩解值高于對照武運粳29196,冷漿黏度、回復值、消減值低于武運粳29196,有可能食味品質好;綜合比較DH036改良系各品質性狀參數(shù),都與武運粳29196相似,該系具備武運粳29196的大部分特質。RVA譜特征值只能作為評價品種蒸煮食用品質的一個參考,從RVA譜特征值尚難判斷改良系食味品質的優(yōu)劣,可通過擴大鑒定范圍,進行食味品評確定[17]。

表4　兩個改良系(DH)及對照(CK)的品質性狀

注：*.顯著高于或低于CK;**.極顯著高于或低于CK;BRR.出糙率;MRR精米率;HRR.整精米率;AR.長寬比;CP.堊白粒率;CH.堊白度;PKV.最高黏度;HPV.熱漿黏度;CPV.膠黏度;BDV.崩解值;SBV.消減值;CSV.回復值;AVS.堿消值。

Note:*.Significantly higher or lower than CK at 0.05 probability level;**.Significantly higher or lower than CK at 0.01 probability level;BRR.Brown rice rate;MRR.Milled rice rate;HRR.Head rice rate;AR.Aspect ratio;CP.Chalky grain rate;CH.Chalkiness;PKV.Peak viscosity;HPV.Hot paste viscosity;CPV.Cool paste viscosity;BDV.Breakdown viscosity;SBV.Setback;CSV.Consistence;AVS.Alkali spreading value.

圖3　兩個改良系(DH)及對照(CK)的田間形態(tài)與外觀品質

3討論與結論

縱觀世界各國水稻育種技術的發(fā)展過程,從一開始的純系育種技術發(fā)展到品種間雜交育種技術,后來又研究出亞種間雜交育種技術及理化誘變育種技術,這是水稻品種改良技術的變革歷程[18]。最近幾十年來,隨著分子生物學和生物技術的快速發(fā)展,分子標記、轉基因技術和基因組科學的發(fā)展對水稻遺傳育種工作影響深遠,在許多方面已經(jīng)改變了傳統(tǒng)水稻育種觀念和育種手段[19-20]。本研究利用分子標記輔助選擇育種和花藥培養(yǎng)技術這種新的育種方法和新的理論體系,從分子層面上優(yōu)化設計優(yōu)良品種。

本研究注重理論與生產(chǎn)實踐的緊密結合,目的是對高產(chǎn)粳稻品種武運粳29196的稻瘟病抗性進行遺傳改良以提高其抗病性。武運粳29196為受體親本,谷梅4號為抗病基因Pigm(t)的供體親本,通過雜交和回交,以及利用與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的標記S95477和S29742進行輔助選擇,對武運粳29196改良系的鑒定結果表明,其稻瘟病的抗性都有了明顯提高。說明利用分子標記輔助選擇聚合抗稻瘟病基因的方法,作用于水稻品種稻瘟病抗性改良是有效、可行的,也證實了基因Pigm(t)的抗病效果是非常有效的。

本研究在選育抗稻瘟病水稻品種的同時,兼顧了農(nóng)藝性狀與稻米品質的選拔,注重分子標記選擇與常規(guī)育種手段的結合,努力使抗性、產(chǎn)量與品質達到同步改良。對改良系進行稻瘟病抗性鑒定的同時,也對其稻米品質進行檢測,篩選農(nóng)藝性狀好、稻米品質優(yōu)的品系。

分子標記輔助選擇在快速篩選含有目的基因的株系上相較于傳統(tǒng)表型選擇的方法,其效率較高[21],將分子標記與花藥培養(yǎng)方法相結合,找到其間的最佳結合點,才能達到既加快育種進程又降低勞動強度和費用的理想效果。本試驗采用分子標記、回交育種及花藥培養(yǎng)相結合,將基因Pigm(t)導入武育粳29196,獲得與輪回親本相似的純合抗病單株。

對于武運粳29196的抗稻瘟病改良,目前完成了一個抗病基因Pigm(t)的導入,已經(jīng)取得了較理想的結果。通過雜交、回交、分子標記輔助選擇和花藥培養(yǎng)相結合構建DH群體,2014年正季對DH株系進行了稻瘟病接種試驗，檢測DH株系對稻瘟病的抗性情況,同年進行了農(nóng)藝性狀及品質性狀的測定。在185個DH株系中,筆者篩選出82個含有抗性基因Pigm(t)的株系,經(jīng)過后續(xù)田間表型鑒定及稻瘟病抗性鑒定后,得到2個單株產(chǎn)量高于武運粳29196抗病性明顯提高的株系。在經(jīng)過品質性狀測定后,從中又選出一個品質性狀較好的株系DH158和一個農(nóng)藝性狀與對照武運粳29196完全相似的抗病株系DH036。這2個改良株系綜合性狀與武運粳29196已十分相近,保持了武運粳29196豐產(chǎn)性的同時稻瘟病抗性又有了明顯的提高,達到了預期目標。

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Marker-assisted Selection and Application of Blast Resistant GenePigm(t) in Rice

WANG Fei1,WANG Liguang1,PAN Meiyao1,NIU Zhongyi2,ZHOU Yong1,LIANG Guohua1

(1.Agricultural College of Yangzhou University,Yangzhou225000,China;2.Wujin Rice Research Institute,Changzhou213000,China)

Abstract：This study was aimed to improve the resistance of Wuyunjing 29196.Blast resistant gene Pigm(t) showed a broad spectrum of strong resistance.Wuyunjing 29196 is an excellent conventional Japonica rice,which has good yielding but sensitive to rice blast.This study was aimed to improve the resistance of Wuyunjing 29196 to blast by MAS and anther culture.GM4,a variety carrying a resistant gene Pigm(t),was used as the donor parent.Two closely linked InDel markers,S95477 and S29742,were employed to select the Pigm(t) gene in each generation.Finally,185 DH (Double haploid) lines were developed from the anthers of BC2F1plants.Among them,82 improved lines with homozygous Pigm(t) were selected.Multiple agronomic traits including grain yield and resistance to rice blast and the rice quality were characterized.Two fine lines,DH036 and DH158 screened out,finally which had increased resistance level and enhanced yield production.More importantly,they had similar plant architecture and other traits.Simultaneously had high resistance to rice blast and quality.The combination of anther culture and marker-assisted selection successfully improved the resistance to rice blast,in a short breeding period.The improved Wuyunjing 29196 with high blast resistance level provided important genetic resources in breeding.

Key words:Rice;Pigm(t);Marker assisted selection;Back cross breeding;Anther culture

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.009

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0051-06

通訊作者：周勇(1983-),男,江蘇泗洪人,副教授,博士,主要從事水稻遺傳育種研究。

作者簡介：王飛(1992-),男,江蘇連云港人,在讀碩士,主要從事水稻遺傳育種研究。梁國華(1965-),男,江蘇盱眙人,研究員,博士,主要從事水稻遺傳育種研究。

基金項目：國家“973”項目(2013CBA01405);國家自然科學基金項目(31100863;31271679);江蘇省普通高校專業(yè)學位研究生科研創(chuàng)新計劃項目(SJLX_0612)

收稿日期：2015-12-04