鎘脅迫下不同大豆品種各器官中鎘和非蛋白巰基物質(zhì)的動態(tài)變化

王　朋， 鄧小娟， 黃益安， 方小龍， 張　杰， 萬海波， 楊存義

(廣東省植物分子育種重點實驗室/國家大豆改良中心 廣東分中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

?

鎘脅迫下不同大豆品種各器官中鎘和非蛋白巰基物質(zhì)的動態(tài)變化

王朋， 鄧小娟， 黃益安， 方小龍， 張杰， 萬海波， 楊存義

(廣東省植物分子育種重點實驗室/國家大豆改良中心 廣東分中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】探討不同大豆品種各器官鎘和非蛋白巰基物質(zhì)的動態(tài)變化，揭示巰基物質(zhì)在大豆鎘抗性和積累中的作用?！痉椒ā吭阪k(Cd)污染的土壤中種植鎘抗性和籽粒積累不同的大豆品種中黃24和華夏3號，采集不同生育時期的根、莖和葉，分析各品種的Cd抗性指標(根系和地上部鮮質(zhì)量)、Cd積累指標(各器官Cd濃度)和非蛋白巰基物質(zhì)[總非蛋白巰基肽(NPT)、谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PC)]的濃度變化?！窘Y(jié)果】在10 mg·kg-1的Cd脅迫下，中黃24不同時期Cd抗性指標明顯低于華夏3號，而中黃24初花期后各器官Cd濃度均顯著地高于華夏3號。Cd脅迫下2個品種隨發(fā)育進程根系中NPT、GSH和PC濃度上升，而葉片中則下降；敏感品種中黃24各器官中巰基物質(zhì)對Cd脅迫響應(yīng)比抗性品種華夏3號更顯著。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，大豆根部巰基物質(zhì)濃度與各器官Cd濃度呈正相關(guān)，且以成熟期最為顯著，而初花期后地上部的PC與各器官Cd濃度呈負相關(guān)?！窘Y(jié)論】在大豆不同生育期不同器官中Cd和非蛋白巰基物質(zhì)濃度變化復(fù)雜，非蛋白巰基物質(zhì)在大豆抵抗Cd脅迫中扮演多種角色。

關(guān)鍵詞：鎘脅迫； 大豆； 非蛋白巰基； 谷胱甘肽； 植物螯合肽

大豆Glycinemax(L.) Merr.是我國主要糧食和飼料原料，各地均有廣泛種植。隨著工業(yè)的快速發(fā)展，廢水、廢液大量排放，重金屬污染的農(nóng)田面積日益增加[1]。鎘(Cd)是污染農(nóng)田的主要重金屬之一，Cd不但會阻礙植物的正常生長，而且通過根系積累在植物的可食部分危害人類的健康[2-4]。Cd污染的土壤中生產(chǎn)的大豆種子容易受到Cd污染[5-8], 但大豆Cd抗性與籽粒積累存在基因型差異[5, 7-8]，利用大豆的遺傳潛力選育抗Cd且低積累的大豆品種可提高大豆品質(zhì)[9-10]。全面了解大豆抗Cd和籽粒重金屬累積的遺傳機制是開展大豆抗Cd、Cd低積累品種選育的基礎(chǔ)。

Cd進入植物體內(nèi)后可與細胞內(nèi)活性物質(zhì)結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化脅迫使細胞受到傷害[11-12]。植物進化了一系列的抗性機制抵御Cd毒害，主要包括：1)植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列抗氧化酶和抗氧化劑克服Cd誘導(dǎo)的氧化脅迫；2)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)維持細胞氧化還原平衡；3)植物體內(nèi)螯合物與Cd結(jié)合；4)Cd區(qū)室化及外排機制等[13-14]。植物體內(nèi)的半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、金屬硫蛋白(MTs)、谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PC)等巰基物質(zhì)可螯合Cd離子，解除Cd的毒害。在水稻Oryzasativa、小麥Triticumaestivum和擬南芥Arabidopsisthaliana等植物中證實巰基物質(zhì)在重金屬螯合、固定等方面起到了重要作用[15-19]，但在遏藍菜Thlaspicaerulescens、白玉草Silenevulgaris、蒿柳Salixviminalis和蜈蚣草Pterisvittata等植物中發(fā)現(xiàn)巰基物質(zhì)的積累與抗重金屬脅迫并無相關(guān)性，抗性品種較敏感品種具有較低巰基物質(zhì)濃度[20-23]。巰基物質(zhì)的結(jié)合與重金屬亞細胞分布相關(guān)，形成PC-Cd螯合物進入液泡后，通過氨基酸循環(huán)再生，最終導(dǎo)致液泡中的重金屬不斷積累，但并未造成巰基物質(zhì)的升高[23-24]。巰基物質(zhì)還是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑和信號物質(zhì)[25]，谷胱甘肽代謝能夠直接減少細胞內(nèi)H2O2的形成[26]。植物體內(nèi)非蛋白疏基物質(zhì)主要包含總非蛋白疏基肽(NPT)、谷光甘肽(GSH)和植物螯肽(PC)[27]。Vazquez等[28]研究大豆和白羽扇豆Lupinusalbus植物中螯合物對鎘脅迫的作用時，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下大豆苗期植株巰基總量、GSH和PC均有增加，但和白羽扇豆相比，大豆苗期植株巰基總量、GSH和PC與鎘抗性無顯著相關(guān)。本研究利用Cd污染的土壤進行盆栽試驗，通過比較在不同發(fā)育時期鎘抗性不同的大豆品種間各器官巰基物質(zhì)的動態(tài)變化，以揭示巰基物質(zhì)與鎘抗性和積累間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料及處理

根據(jù)趙云云等[5, 7-8]的研究結(jié)果，選擇了鎘抗性和籽粒積累不同的大豆品種華夏3號(抗性品種)和中黃24(敏感品種)為研究材料。選取大小一致、飽滿圓潤的大豆種子，用體積分數(shù)為5% 的NaClO浸泡1 min, 去離子水沖洗后播于石英砂(已經(jīng)洗滌、高溫烘干)中發(fā)芽育苗，待幼苗子葉展開時選取大小一致的幼苗移栽于溫室盆中，每個盆中移栽3株幼苗。每盆土壤7 kg，3次重復(fù)，設(shè)對照(土中不添加Cd)和處理(土中加入Cd 10 mg·kg-1)，充分混勻。在整個培養(yǎng)期間采用定量澆水、施肥保證每盆管理一致。

1.2生物量的測定

分別在苗期(第3片復(fù)葉完全展開)、初花期、初莢期和成熟初期根據(jù)取樣要求將一定數(shù)目的大豆植株用自來水從盆中沖洗取出，以確保得到完整的植株，用吸水紙吸干表面水分，分別測定大豆根、莖、葉鮮質(zhì)量，隨后立即放入-20 ℃冰箱中冷凍，用于測定相關(guān)指標?？剐灾笖?shù)(TI)計算如下：TI=Cd處理的生物量/對照的生物量。

1.3各器官鎘濃度的測定

分別從每個重復(fù)當中稱取干樣1 g裝至50 mL三角瓶中，倒入10 mL預(yù)先準備好的φ為69%的HNO3+φ為72%的HClO4混合液(體積比87∶13)浸泡，封口過夜后，放入恒溫電熱板中進行消化，當三角瓶中的液體呈無色透明狀且體積小于1 mL時，將其取出、室溫冷卻，定容50 mL后過濾。采用原子吸收分光光度計(原子吸收光譜法，日立180-80 光譜帶寬度1.3 nm)測定鎘離子含量，精確度為0.01 mg·kg-1[29]。

1.4非蛋白巰基物質(zhì)的測定

NPT含量的測定采用比色法[30]：取鮮樣1 g放置于研缽中, 加入預(yù)冷的體積分數(shù)為5%的SSA(含6.3 mmol·L-1DTPA) 6 mL和少量石英砂冰浴，充分研磨, 4 ℃離心(12 000 r·min-1)15 min,上清液冷藏。取上清液0.2 mL加入0.25 mol·L-1的Tris-HCl(pH 8.3)2.65 mL和10 mmol·L-1的DTNB 0.15 mL，室溫放置15 min，然后在412 nm波長下用分光光度計比色測定。以等量的未加DTNB的溶液作為對照，以GSH-SH為標樣制作標準曲線[19]。

GSH的測定采用比色法[31]：取鮮樣組織1 g放置于研缽中，加入預(yù)冷的體積分數(shù)為5%的 TCA溶液6 mL和少量的石英砂，冰浴充分研磨，4 ℃離心(12 000 r·min-1)15 min,上清液冷藏。取上清液0.2 mL，加入0.25 mol·L-1的Tris-HCL緩沖液(pH 8.3)，搖勻，再加入體積分數(shù)為3%的甲醛溶液0.2 mL，搖勻，室溫靜置20 min后，立刻加入預(yù)先25 ℃水浴的DTNB分析溶液3 mL,搖勻，靜置5 min后立刻在波長為412 nm處測定吸光度，根據(jù)GSH標準曲線計算GSH濃度。

采用差減法計算植物組織內(nèi)PC濃度[32]：

PC濃度=NPT濃度-GSH濃度。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003、SigmaPlot 10.0和SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理、作圖和差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1鎘脅迫下不同生育期大豆品種間鮮質(zhì)量差異

鎘脅迫下2個品種根系和地上部鮮質(zhì)量均比對照有所下降，但抗性品種華夏3號下降幅度小，而敏感品種中黃24下降幅度大(圖1)。2個品種隨Cd脅迫時間延長根系和地上部鮮質(zhì)量差異明顯；抗性品種華夏3號根系鮮質(zhì)量在4個時期分別是對照的77.6%、74.6%、82.3%和78.7%，地上部鮮質(zhì)量分別為對照的 50.8%、69.4%、85.0%和85.6%；而敏感品種中黃24根系鮮質(zhì)量在4個時期分別為對照的51.6%、48.8%、51.1%和41.1%，地上部鮮質(zhì)量分別為對照的62.5%、52.9%、42.0%和47.7%。表明2個品種間對鎘脅迫抗性的差異在初花期后更明顯。

相同部位同一時期不同柱子上凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法) 。

2.2鎘脅迫下各器官鎘濃度的變化

鎘脅迫下不同發(fā)育時期大豆根系鎘濃度遠高于葉片和莖，華夏3號各器官鎘濃度在初莢期后都低于中黃24(圖2)。2個品種根系鎘濃度在不同發(fā)育時期呈不同的變化，苗期敏感品種中黃24的根系鎘濃度顯著低于華夏3號，是華夏3號鎘濃度的75.4%；2個品種根系鎘濃度最高值均出現(xiàn)在初花期且無顯著差異；初莢期至成熟期2個品種根系鎘濃度不斷下降，但中黃24的下降幅度較小，成熟期中黃24根系鎘濃度是華夏3號的163.4%(圖2A)。2個品種莖部鎘濃度在不同發(fā)育時期也呈不同的變化，苗期2個品種莖部Cd濃度差異不顯著，華夏3號苗期后迅速下降至初花期最低然后又緩慢增長，而中黃24不斷增加至成熟期最高，中黃24莖部Cd濃度在初花期、初莢期、成熟期分別是華夏3號的233%、175%和248%(圖2B)。2個品種葉部鎘濃度在不同發(fā)育時期均呈先升后降至成熟期最低的趨勢，苗期中黃24是華夏3號的132.2%，初花期2個品種差異不顯著，初莢期和成熟期中黃24分別是華夏3號的265.5%和160.6%(圖2C)。

相同部位同一時期不同柱子上凡是有一個相同小寫字母者，表示品種間差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法) 。

2.3鎘脅迫下大豆根系各種巰基物質(zhì)濃度的變化

對照條件下2個品種在不同發(fā)育時期根系中NPT濃度變化趨勢相似，初花期前不斷增加，初莢期下降，成熟期又快速增加。鎘脅迫條件下2個品種在不同發(fā)育時期NPT濃度變化完全不同，敏感品種中黃24在苗期大幅增加、初花期和初莢期逐漸下降、成熟期又顯著增加，而抗性品種華夏3號隨發(fā)育不斷增加。2個品種間NPT濃度在同一發(fā)育時期存在差異，對照條件下中黃24號NPT濃度除初莢期外均顯著低于華夏3號，而在鎘脅迫條件下苗期和成熟期中黃24顯著高于華夏3號，初花期差異不顯著，初莢期中黃24顯著低于華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，敏感品種中黃24根系NPT濃度4個時期均高于對照，分別是對照的 447%、133%、120%和193%；抗性品種華夏3號NTP濃度僅在初莢期高于對照，其他3個時期均低于對照，分別為對照的 72.7%、96.4%和94.5%(圖3A)。

對照條件下2個品種不同發(fā)育時期根系中GSH變化趨勢不同，敏感品種中黃24在初花期略有上升，初莢期顯著下降，成熟期達初花期水平；抗性品種華夏3號在初莢期略高于其他3個時期。鎘脅迫下2個品種根系中GSH均呈先增加后減少趨勢。同一發(fā)育時期2個品種間根系中GSH存在差異，對照條件下苗期和初莢期中黃24顯著性低于華夏3號，初花期和成熟期相似；鎘脅迫下苗期和成熟期中黃24根系中GSH顯著高于華夏3號，初花期差異不顯著，初莢期中黃24顯著低于華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同， 敏感品種中黃2 4根系中GSH濃度均顯著高于對照，4個時期分別為對照的 401%、125%、305%和151%；抗性品種華夏3號根系中GSH濃度只在初花期和初莢期顯著性高于對照，4個時期分別為對照的 85.3%、128.6%、123.6%和94.3%(圖3B)。

相同指標同一時期不同柱子上凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法) 。

對照條件下2個品種根系PC濃度隨發(fā)育呈上升趨勢，但華夏3號在初莢期顯著下降。鎘脅迫下2個品種根系PC濃度隨發(fā)育變化趨勢相似，除初莢期有顯著下降外，其他時期呈上升趨勢。同一發(fā)育時期2個品種根系PC濃度存在差異，對照條件下初莢期敏感品種中黃24高于抗性品種華夏3號，其他時期敏感品種中黃24均低于抗性品種華夏3號；鎘脅迫下苗期和成熟期2個品種差異不顯著，但初花期和初莢期敏感品種中黃24均低于抗性品種華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，除初莢期外其他3個時期中黃24根系PC濃度顯著高于對照，4個時期分別為對照的 635.6%、137.6%、78.5%和219.2%，而抗性品種華夏3號根系中PC濃度則顯著低于對照，4個時期分別為對照的 70.5%、84.7%、192.2%和94.3%(圖3C)。

2.4鎘脅迫下大豆莖部各種巰基物質(zhì)濃度的變化

對照條件下2個品種莖部NPT濃度隨發(fā)育變化趨勢不同，中黃24在初花期前有顯著增加后維持不變；華夏3號在初莢期前呈不斷增加，但在成熟期時有所下降。鎘脅迫條件下2個品種莖部NPT濃度隨發(fā)育變化不同，敏感品種中黃24苗期大幅增加后逐漸下降，成熟期略有增加；抗性品種華夏3號初花期大幅增加，初莢期無變化，成熟期顯著下降。同一發(fā)育時期2個品種莖部NPT濃度存在差異，對照條件下只在初花期中黃24高于華夏3號，而鎘脅迫下苗期和成熟期敏感品種中黃24顯著高于抗性品種華夏3號，初花期2個品種相似，初莢期敏感品種中黃24顯著低于抗性品種華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，敏感品種中黃24苗期顯著高于對照，4個時期鎘脅迫下莖部NPT濃度分別為對照的435.7%、100.2%、79.2%和98.1%，而抗性品種華夏3號在苗期和初莢期與對照無顯著差異，4個時期鎘脅迫下NPT濃度分別為對照的98.8%、121.6%、95.0%和69.5%(圖4A)。

對照條件下2個品種莖部GSH均隨發(fā)育逐漸增加。 鎘脅迫下2個品種莖部GSH呈不同的變化趨勢，敏感品種中黃24莖部GSH濃度在苗期快速增加，初花期后逐漸下降；抗性品種華夏3號在初花期顯著增加后保持不變。同一發(fā)育時期2個品種間存在差異，對照條件下初莢期中黃24顯著低于華夏3號，其他時期2個品種GSH濃度差異不顯著；鎘脅迫下苗期中黃24顯著高于華夏3號，初花期和成熟期差異不顯著，初莢期中黃24顯著低于華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，敏感品種中黃24在苗期和初花期顯著高于對照，鎘脅迫下各時期GSH濃度分別為對照的315.2%、124.6%、86.7%和131.9%，而抗性品種華夏3號初花期顯著高于對照，其他時期與對照無顯著差異，各時期鎘處理下GSH濃度分別為對照的100.7%、134.5%、94.2%和84.6%(圖4B)。

對照條件下2個品種莖部PC隨發(fā)育呈相似的變化趨勢，即初莢期前不斷增加，成熟期下降。鎘脅迫下2個品種莖部PC濃度變化趨勢不同，華夏3號在初莢期前增加，成熟期顯著下降；中黃24苗期大幅增加后逐漸下降。同一發(fā)育時期2個品種間存在差異，對照條件下苗期中黃24和華夏3號相似，初花期和成熟期中黃24顯著高于華夏3號，而初莢期中黃24顯著低于華夏3號；鎘脅迫下苗期中黃24顯著高于華夏3號，初花期差異不顯著，初莢期中黃24顯著低于華夏3號，成熟期中黃24顯著高于華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，敏感品種中黃24在苗期顯著高于對照，而初莢期和成熟期顯著低于對照，鎘脅迫下4個時期PC濃度分別是對照的634.3%、83.5%、70.6%和65.5%；抗性品種華夏3號在初莢期和成熟期PC濃度顯著低于對照，而在苗期和初花期與對照差異不顯著，4個時期PC濃度分別是對照的98.8%、107.9%、77.9%和39.2(圖4C)。

相同指標同一時期不同柱子上凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法) 。

2.5鎘脅迫下大豆葉片各種巰基物質(zhì)濃度的變化

對照條件下2個品種葉片中NPT濃度隨發(fā)育呈上升趨勢。鎘脅迫下2個品種葉片中NPT濃度隨發(fā)育表現(xiàn)不同的變化，敏感品種中黃24初莢期前無顯著變化，而成熟期有顯著增加；抗性品種華夏3號則不斷增加。同一發(fā)育時期2個品種間存在差異，對照條件下初花期中黃24顯著低于華夏3號，其他時期差異不顯著；鎘脅迫下苗期中黃24顯著高于華夏3號，初花期和成熟期差異不顯著，初莢期中黃24顯著低于華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，敏感品種中黃24苗期NPT濃度顯著高于對照，其他時期葉部NPT濃度顯著低于對照，鎘脅迫下4個時期葉片NPT濃度分別是對照的118.9%、85.1%、73.8%和60.8%；抗性品種華夏3號初花期和成熟期葉部NPT濃度顯著低于對照，初莢期顯著高于對照，苗期無差異，鎘處理下4個時期葉片NPT濃度分別是對照的101.6%、76.6%、119.1%和69.7%(圖5A)。

對照條件下2個品種葉片中GSH濃度隨發(fā)育時間呈上升趨勢。鎘脅迫下2個品種葉片中GSH濃度隨發(fā)育呈不同的變化，敏感品種中黃24呈小幅增加，而抗性品種華夏3號在初莢期前呈小幅下降，在成熟期有大幅增加。同一發(fā)育時期2個品種間存在差異，對照處理初花期和成熟期中黃24顯著低于華夏3號，苗期和初莢期差異不顯著；鎘脅迫下苗期、初花期和成熟期中黃24顯著低于華夏3號，初莢期差異不顯著。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，鎘脅迫下敏感品種中黃24葉片中GSH濃度在4個時期均顯著低于對照，分別為對照的45.5%、83.7%、82.8%和69.0%；鎘脅迫下華夏3號葉片GSH濃度在初花期與成熟期低于對照，其他時期與對照差異不顯著，4個時期分別為對照的106.1%、77.1%、104.1%和84.3%(圖5B)。

對照條件下2個品種葉片中PC濃度均隨著發(fā)育不斷上升。鎘脅迫下2個品種葉片中PC濃度變化不同，敏感品種中黃24苗期大幅增加后逐漸下降，成熟期略有增加；抗性品種初莢期前不斷增加，成熟期下降。同一發(fā)育時期2個品種間存在差異，對照條件下除初花期外其他時期中黃24均顯著高于華夏3號；鎘脅迫下苗期中黃24顯著高于華夏3號，初莢期中黃24顯著低于華夏3號，而成熟期中黃24顯著高于華夏3號。不同發(fā)育時期2個品種對鎘脅迫響應(yīng)不同，敏感品種中黃24葉片中PC濃度在苗期顯著高于對照，其他時期顯著低于對照，4個時期分別為對照的337.7%、86.2%、66.5%和53.1%；抗性品種華夏3號葉片中PC濃度在初莢期顯著高于對照，其他時期顯著低于對照，4個時期分別為對照的61.3%、76.1%、129.8%和49.5%(圖5C)。

相同指標同一時期不同柱子上凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法) 。

2.6不同時期各器官中巰基物質(zhì)濃度與鎘濃度和抗性指數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

鎘脅迫下不同時期不同器官中巰基物質(zhì)濃度與鎘濃度和抗性指數(shù)之間的相關(guān)性見表1。初花期根系中GSH與各器官鎘濃度呈顯著正相關(guān)，與各器官抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)；成熟期根系中NPT、GSH和PC均與各器官鎘濃度呈顯著正相關(guān)，與各器官抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)。表明發(fā)育前期大豆根系中主要是小分子的GSH響應(yīng)鎘脅迫，而后期根系中NPT、GSH和PC均起到一定的作用。

苗期莖部NPT、GSH和PC與葉部鎘濃度呈顯著正相關(guān)，與根系抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)；初花期時只有莖部GSH與各器官的鎘濃度呈顯著正相關(guān)，而與各器官的抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)；初莢期莖部GSH和初花期相似，但莖部NPT和PC與各器官的鎘濃度呈顯著負相關(guān)，與各器官的抗性指數(shù)呈顯著正相關(guān)；成熟期莖部GSH與根、莖的鎘濃度呈顯著正相關(guān)，與根、地上部的抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)。表明大豆莖部GSH在各時期作用一致， NPT和PC在不同時期作用不同。

苗期葉部GSH與葉部鎘濃度呈顯著負相關(guān)，與根系抗性指數(shù)呈顯著正相關(guān)；葉部PC與葉部鎘濃度呈顯著正相關(guān)，NPT、PC與根系抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)。初花期葉部NPT與各器官的鎘濃度呈顯著正相關(guān)，與各器官的抗性指數(shù)呈顯著負相關(guān)；葉部PC與各器官的鎘濃度呈顯著負相關(guān)，與各器官的抗性指數(shù)呈顯著正相關(guān)。初莢期葉部GSH與葉部鎘濃度呈顯著負相關(guān)，葉部NPT、 GSH均與地上部抗性指數(shù)呈顯著正相關(guān)。成熟期葉部GSH、 PC與各器官鎘濃度均呈顯著負相關(guān)，葉部GSH與各器官抗性指數(shù)呈顯著正相關(guān)。表明在不同時期大豆植株葉部巰基物質(zhì)對鎘脅迫響應(yīng)不同。

表1　大豆各器官中巰基物質(zhì)與鎘濃度和抗性指數(shù)的相關(guān)分析1)

1)TI為根或地上部的抗性指數(shù)；“*”和“**”分別表示0.05和0.01顯著相關(guān)。

3討論與結(jié)論

土壤中的鎘不僅對大豆生長發(fā)育有嚴重的影響，而且積累在籽粒中通過食物鏈危害人類健康[33]。在鎘污染的土壤上種植大豆必須選擇抗Cd、籽粒Cd低積累的大豆品種，而對大豆Cd抗性的評價通常以相對籽粒產(chǎn)量和相對地上部生物量為主要指標，對籽粒Cd積累以籽粒Cd濃度為主要評價指標[7-8, 34]。本研究發(fā)現(xiàn)華夏3號各器官在鎘處理下4個時期均比中黃24有較高的生物量，且其根系和地上部相對值高于中黃24，表明華夏3號的鎘抗性在整個發(fā)育時期表現(xiàn)一致。同時發(fā)現(xiàn)2品種各器官鎘濃度在不同發(fā)育時期不同，成熟期中黃24各器官鎘濃度均顯著高于華夏3號，表明華夏3號低積累特性在成熟期才充分表現(xiàn)。這一結(jié)果與盆栽篩選試驗結(jié)果一致[7]。

植物進化了一系列機制以抵御鎘脅迫，包括減少重金屬生物利用率、控制重金屬進入細胞、螯合重金屬以促進重金屬流出細胞、區(qū)室化隔離、ROS 解毒等，其中，體內(nèi)產(chǎn)生的巰基物質(zhì)(GSH、PC、CYS等)螯合鎘是重要解毒機制之一[18, 35]。巰基物質(zhì)與鎘具有很高的親和性，形成無毒的絡(luò)合物存在于細胞質(zhì)或運輸?shù)揭号葜?，既解除了鎘離子的毒性，又阻斷了鎘離子向其他組織的遷移[36]。同時巰基物質(zhì)GSH還是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑和信號物質(zhì)[25]，GSH代謝能夠直接減少細胞內(nèi)H2O2的形成[26]。本研究發(fā)現(xiàn)鎘抗性和籽粒積累不同的2個大豆品種各器官中巰基物質(zhì)在不同發(fā)育時期的動態(tài)變化不同。苗期鎘脅迫下抗性品種華夏3號根系中NPT、GSH和PC濃度顯著性下降，莖、葉中則無顯著性變化；敏感品種中黃24的NPT濃度在根、莖、葉(尤以根和莖)顯著上升。初花期鎘脅迫下抗性低積累品種華夏3號和敏感品種中黃24的根和莖中NPT、GSH和PC濃度均顯著升高，但葉部NPT、GSH和PC濃度顯著下降，敏感品種更為顯著。初莢期鎘脅迫下抗性品種華夏3根部NPT、GSH和PC濃度顯著高于敏感品種中黃24；敏感品種中黃24莖部NPT、GSH和PC濃度比華夏3號下降更為顯著；抗性品種華夏3號葉部NPT、GSH和PC濃度比敏感低品種中黃24顯著上升。成熟期鎘脅迫下敏感品種中黃24根系NPT、GSH和PC濃度顯著上升，而抗性低積累品種華夏3號根系NPT、GSH和PC濃度無顯著變化；華夏3號莖部和葉部NPT、GSH和PC濃度顯著低于中黃24。表明鎘脅迫下敏感品種中黃24的根、莖和葉中非蛋白巰基物質(zhì)的變化幅度遠高于抗性品種華夏3號，這一現(xiàn)象在遏蘭菜、白玉草、柳蒿、蜈蚣草等植物中也觀察到[20-23]。

有研究發(fā)現(xiàn)品種抗性與巰基物質(zhì)的積累并無顯著相關(guān)，甚至在一些植物中抗性品種巰基濃度低于敏感品種[20, 22-23]。本研究對非蛋白巰基物質(zhì)(NPT、GSH和PC)與抗性指數(shù)的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，不同器官中各種巰基物質(zhì)對抗性貢獻不相同，根系中各發(fā)育時期各種巰基物質(zhì)濃度與抗性呈負相關(guān)；各發(fā)育時期莖部GSH與抗性指標均呈負相關(guān)，而莖部PC自初花期就與抗性呈正相關(guān)，總巰基物質(zhì)只在初莢期呈正相關(guān)；葉部只有GSH與抗性指標在各發(fā)育時期均是正相關(guān)，而葉部PC自初花期就與抗性呈正相關(guān)，總巰基物質(zhì)只在初莢期呈正相關(guān)。

不同發(fā)育時期各器官中非蛋白巰基肽與各器官中鎘積累相關(guān)性不盡相同。根系中各發(fā)育時期各種巰基物質(zhì)濃度與各器官鎘濃度呈正相關(guān)，且以初花期后根系GSH最為顯著。莖部只有GSH與各器官鎘濃度在各發(fā)育時期呈正相關(guān)，而莖部PC初花期至成熟期均與各器官鎘濃度呈負相關(guān)。葉部只有GSH與各器官鎘濃度在各發(fā)育時期呈負相關(guān)；葉部PC苗期與各器官鎘濃度呈正相關(guān)，其他時期呈負相關(guān)。

在鎘脅迫下與螯合相關(guān)的蛋白(PC)和氨基酸(甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸)在鎘低積累品種中具有較高的活性[37]。鎘脅迫下大豆巰基物質(zhì)的變化規(guī)律預(yù)示著大豆中巰基物質(zhì)不僅僅是螯合作用。植物體內(nèi)巰基物質(zhì)的作用有3個方面：一是金屬螯合劑發(fā)揮著解毒作用；二是谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑；三是可作為ROS產(chǎn)生的信號分子[13-14]。鎘脅迫下抗性品種與敏感品種不同時期巰基物質(zhì)變化不盡相同，敏感品種巰基物質(zhì)變化更為顯著，這與遏蘭菜、白玉草、柳蒿、蜈蚣草等植物的結(jié)果[20-23]一致。這可能是由于不同抗性品種巰基物質(zhì)合成機制不同，鎘脅迫下抗性品巰基物質(zhì)與鎘結(jié)合形成螯合物質(zhì)固定在液泡中，然后通過氨基酸循環(huán)，重新形成新的螯合物，而巰基物質(zhì)變化并不大，這一現(xiàn)象也在生菜和石竹等植物中被發(fā)現(xiàn)[23-24]。另一種可能與巰基物質(zhì)的抗氧化功能有關(guān)，鎘脅迫下敏感品種體內(nèi)積累較多活性氧，產(chǎn)生大量巰基物質(zhì)作為內(nèi)源活性氧清除劑清除活性氧，維持細胞代謝穩(wěn)定，而抗性品種體內(nèi)活性氧較低，同時還有其他物質(zhì)可清除活性氧。因此鎘脅迫下大豆中巰基物質(zhì)的作用是多方面的，有待深入研究。

參考文獻：

[1]曾希柏，徐建明，黃巧云，等. 中國農(nóng)田重金屬問題的若干思考 [J]. 土壤學(xué)報， 2013, 50(1): 186-193.

[2]SANITA D, TOPPI L, GABBRIELLI R. Response to cadmium in higher plants [J]. Environ Exp Bot，1999, 41(2): 105-130.

[3]BENAVIDES M P, GALLEGO S M, TOMARO M L. Cadmium toxicity in plants [J]. Brazil J Plant Physiol， 2005, 17(1): 21-34.

[4]LUX A, MARTHINK M, VACULIK M, et al. Root responses to cadmium in the rhizosphere: A review [J]. J Exp Bot， 2011, 62(1): 21-37.

[5]ZHAO Y, FANG X, MU Y, et al. Metal pollution (Cd, Pb, Zn, and As) in agricultural soils and soybean,Glycinemax, in southern China [J]. B Environ Contam Tox，2014, 92(4): 427-432.

[6]ZHUANG P, LI Z A, ZOU B, et al. Heavy metal contamination in soil and soybean near the Dabaoshan Mine, South China [J]. Pedosphere， 2013, 23(3): 298-304.

[7]趙云云，鐘彩霞，方小龍，等. 華南地區(qū)夏播大豆品種鎘耐性及籽粒鎘積累的差異[J]. 大豆科學(xué)， 2013, 32(3): 336-340.

[8]趙云云，鐘彩霞，方小龍，等. 華南地區(qū)11個春播大豆品種抗鎘性的差異[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 35(3): 111-113.

[9]GRANT C A, CLARKE J M, DUGUID S, et al. Selection and breeding of plant cultivars to minimize cadmium accumulation[J]. Sci Total Environ, 2008, 390(2/3): 301-310.

[10]趙云云,郭秀蘭,鐘彩霞,等. 大豆抗鎘污染低積累育種的研究進展[J/OL].分子植物育種(網(wǎng)絡(luò)版)，2011, 9: 1692-1699(2011-08-12)[2015-03-08].http://www.biopublisher.cn/index.php/mpb/article/html/576/.DOI:10.5376/mpb.cn.2011.09.0096.

[11]SHARMA S S, DIETZ K. The relationship between metal toxicity and cellular redox imbalance [J]. Trends Plant Sci, 2009, 14(1): 43-50.

[12]CUYPERS A, KAREN S, JOS R, et al. The cellular redox state as a modulator in cadmium and copper responses inArabidopsisthalianaseedlings [J]. J Plant Physiol，2011, 168(4): 309-316.

[13]LIN Y F, AARTS M G. The molecular mechanism of zinc and cadmium stress response in plants [J]. Cell Mol Life Sci， 2012, 69(19): 3187-3206.

[14]SETH C S, REMANS T, KEUNEN E, et al. Phytoextraction of toxic metals: A central role for glutathione [J]. Plant Cell Environ， 2012, 35(2): 334-346.

[15]HARTLEY-WHITAKER J, AINSWORTH G, VOOIJS R, et al. Phytochelatins are involved in differential arsenate tolerance inHolcuslanatus[J]. Plant Physiol， 2001, 126(1): 299-306.

[16]GALLEGO S M, PENA L B, BARCIA R A, et al. Unravelling cadmium toxicity and tolerance in plants: Insight into regulatory mechanisms [J]. Environ Exp Bot, 2012, 83: 33-46.

[17]GUO J, DAI X, XU W, et al. OverexpressingGSH1 andAsPCS1 simultaneously increases the tolerance and accumulation of cadmium and arsenic inArabidopsisthaliana[J]. Chemosphere， 2008, 72(7): 1020-1026.

[18]SARWAR N, ISHAQ W, FARID G, et al. Zinc-cadmium interactions: Impact on wheat physiology and mineral acquisition[J]. Ecotox Environ Safe， 2015, 122: 528-536.

[19]高可輝. 鎘脅迫及缺硫?qū)λ痉堑鞍讕€基物質(zhì)含量和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[20]EBBS S, LAU I, AHNER B, et al. Phytochelatin synthesis is not responsible for Cd tolerance in the Zn/Cd hyperaccumulatorThlaspicaerulescens(J. & C. Presl) [J]. Planta， 2002, 214(4): 635-640.

[21]LI Y, DHANKHER O P, CARREIR L, et al. Overexpression of phytochelatin synthase inArabidopsisleads to enhanced arsenic tolerance and cadmium hypersensitivity[J]. Plant Cell Physiol， 2004, 45(12): 1787-1797.

[22]WOJAS S, CLEMENS S, HENNIG J, et al. Over expression of phytochelatin synthase in tobacco: Distinctive effects ofAtPCS1 andCePCSgenes on plant response to cadmium[J]. J Exp Bot， 2008, 59(8): 2205-2219.

[23]ANETOLI M, VOOIJS R, TEN BOOKUM W, et al. Arsenate tolerance inSileneparadoxadoes not rely on phytochelatin-dependent sequestration[J]. Environ Pollut， 2008, 152(3): 585-591.

[24]MAIER E A, MATTHEWS R D, MCDOWELL J A, et al. Environmental cadmium levels increase phytochelatin and glutathione in lettuce grown in a chelator-buffered nutrient solution[J]. J Environ Qual， 2003, 32(4): 1356-1364.

[25]JOZEFCZAK M, REMANS T, VANGRONSVELD J, et al. Glutathione is a key player in metal-induced oxidative stress defenses[J]. Int J Mol Sci， 2012, 13(3): 3145-3175.

[26]JOZEFCZAK M, KEUNEN E, SCHAT H, et al. Differential response ofArabidopsisleaves and roots to cadmium: Glutathione-related chelating capacity vs antioxidant capacity[J]. Plant Physiol Bioch， 2014, 83: 1-9.

[27]ZAGORCHEV L, SEAL C E, KRANNER I, et al. A central role for thiols in plant tolerance to abiotic stress [J]. Int J Mol Sci，2013, 14(4): 7405-7432.

[28]VAZQUEZ S, GOLDSBROUGH P, CARPENA R O. Comparative analysis of the contribution of phytochelatins to cadmium and arsenic tolerance in soybean and white lupin[J]. Plant Physiol Bioch， 2009, 47(1): 63-67.

[29]WEI S, LI Y, ZHAN J, et al. Tolerant mechanisms ofRorippaglobosa(Turcz.) Thell. hyper accumulating Cd explored from root morphology[J]. Bioresource Technol， 2012, 118: 455-459.

[30]RAMA DEVI S, PRASAD M. Copper toxicity inCeratophyllumdemersumL. (Coontail), a free floating macrophyte: Response of antioxidant enzymes and antioxidants[J]. Plant Sci， 1998, 138(2): 157-165.

[31]GUPTA M, RAI U N, TRIPATHI R D, et al. Lead induced changes in glutathione and phytochelatin inHydrillaverticillata(lf) Royle[J]. Chemosphere， 1995, 30(10): 2011-2020.

[32]BHARGAVA P, KUMAR SRIVASTAVA A, URMI S, et al. Phytochelatin plays a role in UV-B tolerance in N2-fixing cyanobacteriumAnabaenadoliolum[J]. J Plant Physiol， 2005, 162(11): 1220-1225.

[33]GILL S S, TUTEJA N. Cadmium stress tolerance in crop plants[J]. Plant Signal Behav， 2011, 6(2): 215-222.

[34]LI H, DONG Y, YIN H, et al. Characterization of the stress associated micro RNAs inGlycinemaxby deep sequencing[J]. BMC Plant Biol， 2011, 11: 170.

[35]VERBRUGGEN N, HERMANS C, SCHAT H. Molecular mechanisms of metal hyper accumulation in plants[J]. New Phytol， 2009, 181(4): 759-776.

[36]LI T, DI Z, ISLAM E, et al. Rhizosphere characteristics of zinc hyperaccumulatorSedumalfrediiinvolved in zinc accumulation[J]. J Hazard Mater， 2011, 185(2/3): 818-823.

[37]AHSAN N, NAKAMURA T, KOMATSU S. Differential responses of microsomal proteins and metabolites in two contrasting cadmium (Cd)-accumulating soybean cultivars under Cd stress[J]. Amino Acids， 2012, 42(1): 317-327.

【責任編輯周志紅】

Dynamic changes of cadmium and non-protein thiol in different organs of different soybean genotypes under cadmium stress

WANG Peng, DENG Xiaojuan, HUANG Yi’an, FANG Xiaolong, ZHANG Jie, WAN Haibo, YANG Cunyi

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding/Guangdong Sub-center of National Soybean Improvement

Center/College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China)

Abstract：【Objective】 Dynamic changes of cadmium and non-protein thiols in different soybean genotypes were researched to investigate effects of non-protein thiols on Cd tolerance and accumulation of soybean.【Method】The soybean varieties of Zhonghuang24 and Huaxia3 were planted in the pots with contaminated soil. Roots, shoots and leaves were collected in different periods. Cd tolerance indexes (including root and shoot fresh mass), Cd accumulation and the concentrations of non-protein thiols [including the total of non-protein thiol peptides (NPT), glutathione (GSH) and phytochelatins(PC)] of soybeans in different periods were determined. 【Result】The resistance indexes of Zhonghuang24 were significantly lower than those of Huaxia3 in different periods at the Cd concentration of 10 mg·kg-1, and Cd accumulations in all organs were higher than those of Huaxia3 after flowering stage (especially at pod and mature stages). The NPT, GSH and PC concentrations increased in root and reduced in leaf along with the development progress，and the effects of non-protein thiols in Zhonghuang24 under Cd stress were stronger those of Huaxia3. The correlation analysis indicated that there was a positive correlation between thiol concentration in root and the Cd concentration in all organs，especially at mature stage. There was a negative correlation between PC concentrations in stem and leaf after flowering stage, especially more significant at pod and mature stages. 【Conclusion】The concentrations of thiols and Cd in soybean organs show complex changes at different growth stages under Cd stress. Non-protein thiols play multiple roles in Cd detoxification and transportation at different growth stages.

Key words：Cd stress; soybean; non-protein thiol; glutathione; phytochelatin

中圖分類號：S565.1；X171.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)02- 0042- 09

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31271745)； 廣東省科技計劃項目(2013B020301)； 國家科技支撐計劃(2011BAD35B06)； 863計劃(2012AA101106)

作者簡介：王朋(1988—)，男，碩士研究生， E-mail：wp.102300@163.com；通信作者：楊存義(1966—)，男，副教授，博士，E-mail：ycy@scau.edu.cn

收稿日期：2015- 05- 16優(yōu)先出版時間：2016- 01- 18

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160118.1513.010.html

王朋， 鄧小娟， 黃益安，等.鎘脅迫下不同大豆品種各器官中鎘和非蛋白巰基物質(zhì)的動態(tài)變化[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016,37(2):42- 50.