黑果枸杞果實提取物的抑菌效果研究

向延菊，白紅進(jìn)，張美娥，朱麗霞，*（.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室，新疆阿拉爾843300）

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黑果枸杞果實提取物的抑菌效果研究

向延菊1，2，白紅進(jìn)1，張美娥1，朱麗霞1，2，*
（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室，新疆阿拉爾843300）

摘要：以野生黑果枸杞果實為原料，分別用95%乙醇和水浸提黑果枸杞果實中的抑菌成分，研究黑果枸杞提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、啤酒酵母6種菌的抑菌效果，并用抑菌效果較好的醇提液進(jìn)行供試菌的最小抑菌濃度試驗；研究pH、溫度對提取液抑菌效果的影響。結(jié)果表明：黑果枸杞的醇提液和水提液均對以上細(xì)菌、霉菌、酵母菌有一定的抑菌效果，且對細(xì)菌的抑菌效果優(yōu)于霉菌和酵母菌；醇提液的抑菌效果比水提液的抑菌效果好；醇提液對不同菌種的最小抑菌濃度有所不同，其中對黑曲霉和啤酒酵母的最小抑菌濃度是1g/mL，對青霉的最小抑菌濃度是0.5 g/mL，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度是0.125 g/mL，而對金黃色葡萄球菌的是0.062 5 g/mL；提取液在酸性條件下抑菌效果顯著，高溫長時間處理可降低其抑菌活性。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞；抑菌性；穩(wěn)定性

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）系茄科枸杞屬多年生灌木植物，分布于山西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等省[1]；其中，我國新疆、甘肅分布較多，且主要分布于新疆塔里木下游地區(qū)，屬于典型的荒漠植物[2]，而甘肅則主要分布于河西走廊地區(qū)、黑河流域沿岸及其濕地地區(qū)。黑果枸杞果實在藏藥中稱“旁瑪”，根據(jù)《晶珠本草》記載，黑果枸杞味甘、性平、清心熱、用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥。據(jù)《維吾爾藥志》記載，維吾爾醫(yī)生常用黑果枸杞果實及根皮治療尿道結(jié)石、癬疥、齒齦出血等癥，民間作滋補(bǔ)強(qiáng)壯以及降壓藥[3]。黑果枸杞果實含有大量人體所需的氨基酸、微量元素、維生素及β-胡蘿卜素等成分[4-5]，其營養(yǎng)成分與寧夏枸杞相似[6]。李進(jìn)、李彩霞、汪河濱[7-9]等研究發(fā)現(xiàn)黑果枸杞提取物和黑果枸杞色素在一定濃度范圍內(nèi)具有抗氧化活性。但鮮見有黑果枸杞果實提取物的抑菌性報道。本研究用95 %乙醇和水浸提黑果枸杞中的抑菌成分，研究黑果枸杞提取液對細(xì)菌、霉菌、酵母菌的抑菌效果、pH、溫度對其提取液抑菌效果的影響，以期探索黑果枸杞作為藥品、功能食品的成效，為其進(jìn)一步綜合利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

黑果枸杞：采自新疆阿拉爾市塔里木河畔。采收當(dāng)日從枝上剪下，置于通風(fēng)處自然陰干。95 %乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、蔗糖：均為國產(chǎn)AR級分析純；瓊脂、牛肉浸膏、蛋白胨：均為國產(chǎn)RC級分析純；PDA培養(yǎng)基：用于霉菌和酵母菌的培養(yǎng)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于細(xì)菌的培養(yǎng)。

1.2供試菌種

細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（StapHylocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、大腸桿菌（Eschefichiacoli）；霉菌：青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillus niger）；酵母菌：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）。所有菌種均來自于塔里木盆地生物資源保護(hù)利用省部共建重點(diǎn)實驗室的微生物研究室。

1.3儀器與設(shè)備

SPX-250C恒溫恒濕培養(yǎng)箱、HPX-9272MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、SW-CJ-1F超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DL-1電子萬用爐、101-5ARS電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RC2電磁加熱器：意大利VELP；XW-80A微型旋窩混合儀：上海滬西分析儀器有限責(zé)任公司；DZKW-S-6電熱恒溫不銹鋼水浴鍋：鞏義英峪予華儀器廠。

1.4方法

1.4.1黑果枸杞水提液的制備方法

取洗凈晾干的樣品50 g充分破碎后盛于燒杯中，按固液比1∶5（g/mL）加入蒸餾水，于25℃左右浸提12 h后移取上清液待用，再加入蒸餾水冷浸，如此反復(fù)3次，將3次所得浸提液合并，于40℃水浴濃縮，加蒸餾水定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為1 g/mL的黑果枸杞水提浸提液。

在粉彩瓷畫中，花鳥題材的作品是其主要的表現(xiàn)形式。在不斷發(fā)展的過程中，粉彩瓷畫不斷學(xué)習(xí)進(jìn)步，承前人之精華，繼現(xiàn)代之創(chuàng)新，才得以讓花鳥題材的粉彩瓷畫在傳承的過程中不斷發(fā)展，不斷發(fā)揚(yáng)。

1.4.2黑果枸杞醇提液的制備方法

取洗凈晾干的樣品50 g充分破碎后盛于燒杯中，按固液比1∶5（g/mL）加入95 %的乙醇，于25℃左右浸提12 h后移取上清液待用，再加入乙醇冷浸，反復(fù)3次，將3次所得浸提液混合，真空濃縮，得到一定體積的濃縮液，加95 %的乙醇并定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的黑果枸杞乙醇提取液。

1.4.3菌種的活化及菌懸液的制備方法

1）菌種的活化

預(yù)先將供試菌用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行活化，細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24 h，霉菌和酵母菌在28℃培養(yǎng)48 h～72 h。

2）菌懸液的制備

在超凈工作臺內(nèi)取無菌水4.5 mL于試管中，將活化好的菌種用接種環(huán)挑取1環(huán)～2環(huán)放入無菌水中，充分振蕩。

1.4.4.1黑果枸杞的抑菌效果研究方法—濾紙片法

將濾紙制成6 mm的濾紙片，用報紙包上于170℃殺菌2 h。再用無菌鑷子夾取相同數(shù)量的濾紙片置于含有相同體積的提取液的培養(yǎng)皿中，浸泡30 min后倒出提取液，在超凈工作臺上吹干濾紙片。吸取0.1 mL的菌懸液于滅菌后的培養(yǎng)皿中，然后將冷卻至約50℃的培養(yǎng)基倒入上述平皿中，每皿15 mL，充分混勻。將吹干的濾紙片用無菌鑷子放在供試菌的培養(yǎng)基上，每皿3片，呈正三角形。然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培養(yǎng)48 h以外，其余細(xì)菌均采用37℃培養(yǎng)24 h），待培養(yǎng)時間到后，觀察菌種的生長情況，測定抑菌圈的直徑。

1.4.4.2最小抑菌濃度的確定

在無菌條件下，將抑菌效果最好的醇提取原液（質(zhì)量濃度為1 g/mL）用無菌水稀釋得濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 63 g/mL的乙醇提取液；在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1 mL不同濃度的稀釋液，然后倒入15mL培養(yǎng)基充分混勻，待其凝固后吸取0.1 mL供試菌懸液于平板上涂布均勻。放入適宜的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培養(yǎng)48 h以外，其余細(xì)菌均采用37℃培養(yǎng)24 h），待培養(yǎng)時間到后，觀察菌種的生長情況。

1.4.4.3 pH對黑果枸杞提取液抑菌效果的影響

選取同一供試菌種，在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1mL pH為3、4、5、6、7、8、9的最低抑菌濃度下的提取液，再倒入15 mL培養(yǎng)基充分混勻，待其凝固后吸取0.1 mL供試菌懸液于平板上涂布均勻。放入適宜的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培養(yǎng)48 h以外，其余細(xì)菌均采用37℃培養(yǎng)24 h），待培養(yǎng)時間到后，觀察菌種的生長情況。

1.4.4.4溫度對黑果枸杞提取液抑菌活性的影響

在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1 mL經(jīng)60、80、100、121℃熱處理15 min的最低抑菌濃度下的提取液，再倒入15 mL培養(yǎng)基充分混勻，待其凝固后吸取0.1 ml供試菌懸液于平板上涂布均勻。放入適宜的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（除酵母、青菌和黑曲霉在28℃培養(yǎng)48 h以外，其余細(xì)菌均采用37℃培養(yǎng)24 h），待培養(yǎng)時間到后，觀察菌種的生長情況。

2結(jié)果與分析

2.1不同溶劑提取液抑菌效果比較

移取0.1 mL的供試菌種的菌懸液于平皿中，加入15 mL培養(yǎng)基，充分混勻，待冷卻凝固后，將已滅菌的濾紙片放入浸提液中浸泡30 min后于超凈工作臺吹干，將濾紙片放在含有供試菌種的培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗結(jié)果見表1。

表1黑果枸杞提取液對供試菌的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of inhibition zone of extracting solution of Lycium ruthenicum Murr. acting on the selected bacteriamm

從表1可知，黑果枸杞的水提液、乙醇提取液對細(xì)菌、酵母、霉菌都有一定的抑菌效果。95 %乙醇提取液的抑菌效果優(yōu)于水提液；兩種提取液對5種微生物的抑菌效果順序依次為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞青霉＞黑曲霉＞啤酒酵母，且兩種提取液均對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較好的抑菌效果。

2.2醇提液對各種菌的最小抑菌濃度

依據(jù)2.1試驗結(jié)果，選擇抑菌效果較好的醇提液做最小抑菌濃度試驗，試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，黑果枸杞醇提液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度是0.125 g/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度是0.062 5 g/mL，對黑曲霉和啤酒酵母的最小抑菌濃度是1 g/mL，對青霉的最小抑菌濃度是0.5 g/mL。本試驗進(jìn)一步說明黑果枸杞提取液對細(xì)菌的抑菌效果要比對霉菌的抑菌效果要好，其中，對金黃色葡萄球菌有最好的抑菌效果。

表2黑果枸杞醇提液對供試菌種的最小抑菌濃度Table 2 The minimum antibacterial concentration of ethanol extract of Lycium ruthenicum Murr. acting on the selected bacteria

2.3 pH對黑果枸杞提取液抑菌作用的影響

以抑菌效果較好的細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）作為測試菌種，調(diào)節(jié)最低抑菌濃度下提取液的pH，觀察其對黑果枸杞提取液的抑菌效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 pH對黑果枸杞提取液液抑菌活性的影響Table 3 The influence of pH value on antibacterial activity of extracting solution of Lycium ruthenicum Murr.

從表3可知，黑果枸杞提取液在酸性及中性條件下有較好的抑菌活性，尤以pH≤6時抑菌效果較好。由于在酸性條件下能引起非極性酚類化合物上所帶酚羥基電離度變小，疏水性增強(qiáng)，酚類等更易溶于細(xì)胞膜的脂相及蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，因而降低pH，抑菌效果好。

2.4溫度對黑果枸杞提取液抑菌活性的影響

將最低抑菌濃度下的提取液分別置于60、80、100、121℃熱處理15 min，選取同一供試菌種經(jīng)過上述處理（操作方法與最小抑菌濃度的測定方法相同），得溫度對黑果枸杞提取液抑菌活性的影響結(jié)果見表4。

從表4可知，較低溫度（60、80℃）處理對黑果枸杞提取液的抑菌效果無影響，其熱穩(wěn)定性較好，100℃以上長時間處理后其抑菌效果不明顯。可能是高溫使提取液中的抑菌物質(zhì)發(fā)生了物理或化學(xué)變化而使其抑菌活性下降。

表4溫度對黑果枸杞提取液抑菌活性的影響Table 4 The influence of temperature on antibacterial activity of extracting solution of Lycium ruthenicum Murr.

3　結(jié)論

本研究以塔里木河畔野生黑果枸杞為研究對象，用水提法和醇提法（95 %的乙醇）提取黑果枸杞中的抑菌成分，對供試菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、啤酒酵母等進(jìn)行抑菌試驗和穩(wěn)定性的研究，結(jié)果表明：

1）同一菌種在不同的浸提條件下抑菌效果有明顯差異，同一浸提條件對不同供試菌種也存在著較大差異。其中醇提液（95 %的乙醇）的抑菌效果優(yōu)于水提液，兩種提取方法對各種供試菌的抑菌效果均是細(xì)菌＞霉菌＞酵母。對于6種供試菌種，即大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、啤酒酵母，水提液的抑菌直徑分別為20.5、20.05、19.95、9.45、8.55、6.5 mm；醇提液的抑菌圈直徑分別為25、24.65、24.55、12.05、10.55、7.45 mm。

2）不同菌種的最小抑菌濃度有所不同，其中黑曲霉和啤酒酵母的最小抑菌濃度是1 g/mL，青霉的最小抑菌濃度是0.5 g/mL，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的是0.125 g/mL，金黃色葡萄球菌的是0.062 5 g/mL。

3）黑果枸杞提取物的抑菌圈大小與其相應(yīng)的最小抑菌濃度（MIC）值不一定成正相關(guān)關(guān)系。黑果枸杞95 %醇提液對大腸桿菌的抑菌圈直徑（25 mm）大于金黃色葡萄球菌（24.65 mm），但是醇提液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.062 5 g/mL，此值卻小于大腸桿菌的最小濃度0.125 g/mL。

4）酸性條件下，黑果枸杞提取液抑菌效果較顯著，有較好的抑菌活性；pH＜6時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果均顯著。黑果枸杞提取液經(jīng)過熱處理時，在100℃以下時熱穩(wěn)定性很好，抑菌效果明顯；在超過100℃時抑菌效果不明顯。

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Study on Antibacterial Activity of Extracting Solution of Fruits of Lycium ruthenicum Murr.

XIANG Yan-ju1，2，BAI Hong-jin1，ZHANG Mei-e1，ZHU Li-xia1，2，*
（1. College of Life Science，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China；2. Xinjiang Production & Construction Corp Key Laboratory for Advanced Processing of Southern Xinjiang Local Agricultural Products，Alar 843300，Xinjiang，China）

Abstract：Antibacterial activity of extracting solution，which was extracted from fruits of Lycium ruthenicum Murr. using 95 % ethanol and water respectively as solvent，on testing microorganisms that were Eschefichia coli，StapHylocus aureus，Bacillus subtilis，Penicillium，Spergillus nigercans，Saccharomyces cerevisiae Hansen was discussed. Extracting solution with 95 % ethanol that had better antibacterial activity than one with water was used to do experiments of the minimum bacteriostasis concentration of extraction on six kinds of microorganisms. The influence of pH value and temperature on the antibacterial activity of extracting solution was researched. The results showed，that extracting solution with 95 % ethanol and water had definite antibacterial activity for six kinds of microorganisms，the antibacterial activity of extracting solution for bacteria was better than for mould and yeast，and the antibacterial activity of extracting solution with 95 % ethanol was better than one with water. The minimum antibacterial concentration of ethanol extract of Lycium ruthenicum Murr. acting on Aspergillus niger，Saccharomyces cerevisiae Hansen，Penicillium，Eschefichia coli，Bacillus subtilis，and StapHylocus aureus were 1 g/mL，1 g/mL，0.5 g/mL，0.125 g/mL，0.125 g/mL and 0.062 5 g/mL respectively. Extracting solution of Lycium ruthenicum Murr had better antibacterial activity under acid condition and lower one under high temperature for a long time treatment.

Key words：Lycium ruthenicum Murr.；antibacterial activity；stability

收稿日期：2014-08-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.007

*通信作者：朱麗霞（1975—），女，副教授，碩士，研究方向：食品微生物及傳統(tǒng)發(fā)酵食品。

作者簡介：向延菊（1970—），女（土家），副教授，碩士，研究方向：園藝產(chǎn)品貯藏與加工。

基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)高新技術(shù)研究發(fā)展計劃《黑果枸杞活性成分的提取及其產(chǎn)品開發(fā)》（2007GX20）