絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷的保護性研究

劉春杰，董立珉，鄭亞萍，康紅鈺（漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南漯河462000）

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絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷的保護性研究

劉春杰，董立珉，鄭亞萍，康紅鈺
（漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南漯河462000）

摘要：觀察絲瓜提取物（Luffaextract，LE）對β-淀粉樣蛋白（Aβ25－35）誘導的PC12細胞損傷的保護作用。應用Aβ25－35造成神經(jīng)細胞損傷模型，用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應（MTT）比色法檢測各劑量組絲瓜提取物對PC12細胞活力的變化，檢測過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）活性水平，通過蛋白印跡試驗（Western Blotting）來檢測B細胞淋巴瘤基因-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）的表達水平。絲瓜提取物劑量組PC12細胞存活率高于模型組，GSHPx活性顯著增強，CAT含量顯著增加（P<0.01或P<0.05），Bax表達水平降低，Bcl-2表達增高，與模型組比較，差異顯著（P<0.05～P<0.01）。絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷有明顯的保護作用。

關鍵詞：絲瓜提取物；PC12細胞；MTT檢測；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

老年性癡呆（Alzheimer’s disease，AD）的病理性特征是老年斑（senile plaque，SP），而SP的核心成分是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），正常生理情況，Aβ具有營養(yǎng)因子的作用，但高濃度的長鏈Aβ往往具有神經(jīng)毒性[1]，Aβ的產(chǎn)生、積聚增加是引起神經(jīng)元退化和死亡的主要機制。Aβ可通過多種途徑產(chǎn)生過氧化物和自由基，從而加劇過氧化損傷對神經(jīng)細胞的傷害[2]。

絲瓜為葫蘆科植物，近年來證明絲瓜有增強免疫、抗應激、抗病毒、促進生長等生理功能，能促進記憶的獲得、鞏固和再現(xiàn)，有促智作用。絲瓜提取物有明顯抗氧化作用，用于美容可延緩衰老，廣泛用于洗滌日用品[3]。本研究將探討絲瓜提取物對β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）損傷PC12細胞的神經(jīng)保護作用，初步探討絲瓜提取物對AD的神經(jīng)保護機制。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

絲瓜提取物：西安森冉生物有限公司；PC12細胞：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；MTT、Aβ25-35：Sigma公司；CAT、GSH-Px檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清：杭州四季青工程材料研究所；Bcl-2、Bax抗體：SantaCruz生物技術公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器

UV-9200紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；高速冷凍離心機：上海創(chuàng)賽科學儀器有限公司；電熱恒溫水槽：寧波天恒儀器廠；二氧化碳培養(yǎng)箱：Thermo公司；超凈工作臺：TBD生物儀器廠；EPOCH酶標儀：美國BioTek公司；凝膠掃描成像分析系統(tǒng)：美國startganee。

1.3 PC12細胞培養(yǎng)及建立損傷模型

用含15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5 %CO2飽和濕度條件下的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d～3 d換液1次，貼壁生長的細胞，加入0.25 %胰蛋白酶消化，細胞調(diào)整為1×105個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)細胞進入對數(shù)生長期細胞，進行各項指標檢測。離體培養(yǎng)的PC12細胞分為6組：空白組、模型組、絲瓜提取物高劑量組、絲瓜提取物中劑量組、絲瓜提取物低劑量組。模型組加入經(jīng)老化處理的Aβ25-35（終濃度為20 μmol/L）培育36 h，建立AD細胞模型，絲瓜提取物各劑量組分別用終濃度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）過夜培養(yǎng)共2 h后，再加入終濃度為20 μmol/LAβ25-35共同培養(yǎng)36 h，每組8孔，每孔200 μL。

1.4 MTT比色法檢測細胞活力

將處于對數(shù)生長期的PC12細胞制成2×105個/mL懸液，置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)進行鋪板，每孔200 μL，分別給與不同處理因素作用24 h，MTT檢測時棄掉上清，再加入培養(yǎng)基180 μL，每孔再加MTT 20 μL，37℃培養(yǎng)4 h，然后吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩10 min后在酶標儀于560 nm波長處讀取標本的吸光度，各組的吸光度與對照組的吸光度比值作為細胞的活力。按細胞相對活力計算公式：相對活力/%=[（處理組平均吸光度值－空白對照平均吸光度值）/（正常組平均吸光度值－空白對照組平均吸光度值）]×100。

1.5絲瓜提取物對氧化應激的PC12細胞中抗氧化能力的影響

取對數(shù)生長期細胞，用胰酶將細胞制成2×105個/mL懸液并接種于6孔培養(yǎng)板。絲瓜提取物用終濃度（30.75、18.75、9.375 μg/mL）預處理30 min，再加入終濃度為20μmol/LAβ25-35共同培養(yǎng)24h，完成給藥及Aβ25-35處理后，超聲破碎收集的細胞，4℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒方法測定細胞勻漿中CAT、GSH－Px活力。

1.6 Western blotting分析

加藥處理細胞24 h后，收集細胞并洗滌，SDSPAGE電泳分離總蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5 %的脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉過的膜用TBST洗滌3次，將膜放入雜交袋內(nèi)，大鼠Bcl-2、Bax及β-actin-抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記兔抗大鼠IgG 37℃孵育1 h，TBS漂洗，ECL法顯色。凝膠成像系統(tǒng)分析掃描各條帶灰度值，計算目的條帶與內(nèi)參照的灰度比值。

1.7統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均以X±S表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，t檢驗法比較各組間差異，P＜0.05則認為組間差異顯著。

2　結(jié)果

2.1絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞毒性的保護效果

與空白組相比，20 μmol/L的Aβ25-35處理后的細胞存活率明顯下降，僅為55.23 %，具有顯著差異性（P＜0.01）；當PC12預先經(jīng)絲瓜提取物處理后再加Aβ25-35，細胞存活率顯著增加，并呈現(xiàn)劑量依耐性的趨勢，在絲瓜提取物（30.75、18.75、9.375 μg/mL）處理后細胞存活率分別能達到74.72 %、68.15 %及58.01 %。其中，9.375 μg/mL組與模型組相比，無統(tǒng)計學意義，而絲瓜提取物30.75、18.75 μg/mL可以有效抑制Aβ25-35所致的細胞損傷，提高細胞生存率，與模型組比較，有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）結(jié)果見表1。

表1 MTT檢測不同濃度的絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞毒性的保護作用Table 1 MTT test different concentrations of luffa extract protective effects on cytotoxicity of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.2絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞抗氧化酶活性的影響

與空白組比較，20 μmol/L的Aβ25-35處理PC12細胞后，細胞內(nèi)CAT、GSH-PX活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，絲瓜提取物各劑量組可顯著增加CAT、GSH-PX活性（P＜0.01，0.05）。且具有一定的劑量相關性，見表2。

表2絲瓜提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞中CAT、GSH-PX的影響Table 2 Effect of luffa extract on CAT，GSH-PX of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.3絲瓜提取物對Aβ25－35誘導PC12細胞Bcl-2和Bax表達變化的影響

與空白組比較，20 μmol/L的Aβ25-35處理PC12細胞模型組，Bax表達明顯升高（P＜0.01），Bcl-2表達明顯降低（P＜0.01），Bcl-2/Bax表達比下降；與模型組比較，絲瓜提取物高、中、低劑量組Bax表達明顯降低（P＜0.01），Bcl-2表達明顯升高（P＜0.01），Bcl-2/Bax表達水平的比值與模型組比較明顯上升。見表3和圖1。

表3絲瓜提取物對Aβ25－35誘導PC12細胞Bcl-2和Bax表達變化的影響Table 3 Effect of luffa extract on expression changes of Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25－35

1.空白組；2.模型組；3.LE低劑量組；4.LE中劑量組；5.LE高劑量組。圖1絲瓜提取物對Aβ25－35引起的相關蛋白表達的影響Fig.1 Effect of luffa extract on protein expression induced by Aβ25-35

3　結(jié)論

近年來研究表明，人體隨年齡增長所發(fā)生的退行性變化是細胞正常代謝過程中所產(chǎn)生的過量自由基副作用的結(jié)果。如果機體CAT、GSH-PX等抗氧化酶等減少，將導致體內(nèi)自由基生成增加，加強過氧化反應，使組織和細胞受到破壞，從而使組織功能下降，引起生物體衰老。本研究表明Aβ25-35引起PC12細胞內(nèi)CAT、GSH-PX等酶水平的降低，而PC12細胞經(jīng)絲瓜提取物預處理后，能明顯提高Aβ25－35抑制誘導的細胞內(nèi)CAT、GSH-PX酶的水平，從而降低細胞內(nèi)的氧化應激水平。減輕或阻斷脂質(zhì)過氧化物作用，保護機體免受過氧化氫物的損害，延緩細胞的衰老損傷，從而預防自由基導致的疾病的發(fā)生[4-5]。

Bcl家族中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的平衡對細胞是否進入凋亡通路起著重要的作用，即Bc1-2/Bax的比值決定了細胞是否發(fā)生凋亡[6-7]。試驗結(jié)果顯示，模型組Bc1-2蛋白表達反應性降低，Bax表達增強，Bc1-2/Bax的比值下降，促進細胞凋亡的發(fā)生。經(jīng)絲瓜提取物干預后，Bcl-2表達增強，Bax表達減弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制細胞凋亡，表明絲瓜提取物可抑制細胞凋亡。絲瓜提取物對AD小鼠腦神細胞的保護作用，可能是通過上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Bax蛋白的表達，抑制細胞凋亡而實現(xiàn)，從而達到改善老年性癡呆的作用。

綜上，絲瓜提取物對Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷有著明顯的保護作用，可能是通過增強PC12細胞的抗氧化應激和抗凋亡作用，但其防治AD的機制還有待于進一步的研究。

參考文獻：

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The Protective Effect of Luffa Extract on Injury of PC12 Cells Induced by Aβ25-35

LIU Chun-jie，DONG Li-min，ZHENG Ya-ping，KANG Hong-yu
（Luohe Medical College，Luohe 462000，Henan，China）

Abstract：To study the protective effect of luffa extract on injury of PC12 cells induced by amyloid β protein （Aβ25-35）. Neurons injury model was induced by Aβ25-35. MTT assay was used to detect the cellular viability after different concentrations of luffa extract. The activity of catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were detected. The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blotting. Compared with the control group，the cellular viability of luffa extract group was increased，the activity of GSH -Px and CAT were significantly increased（P<0.01，P<0.05），the expression of Bax was decreased and Bcl-2 was increased（P< 0.05-P<0.01）. luffa extract can protect PC12 cells from Aβ25-35induced cytotoxicity.

Key words：luffa extract；PC12 cells；MTT assay；CAT；GSH-Px；Bcl-2；Bax

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.006

作者簡介：劉春杰（1971—），女（漢），副教授，研究生，研究方向：老年病及內(nèi)分泌藥理。

基金項目：河南省骨干教師資助課題（2011GGJS-281）；漯河醫(yī)學高等?？茖W校校級科研課題（2014-S-LMC04）