CD11c和MHC-Ⅱ在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的相關(guān)性

張楠楠，石 海，許建明，胡乃中

◇臨床醫(yī)學(xué)研究◇

CD11c和MHC-Ⅱ在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的相關(guān)性

張楠楠，石 海，許建明，胡乃中

目的探討樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）的數(shù)量及成熟情況在肝細(xì)胞性肝癌（簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌）中的表達(dá)及其與肝癌微血管密度（MVD）的相關(guān)性。方法收集50例肝癌患者術(shù)后癌組織及癌旁組織標(biāo)本，并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)石蠟切片中DCs特異性標(biāo)志CD11c、MVD標(biāo)志CD34以及DCs成熟標(biāo)志的主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類(lèi)分子（MHC-Ⅱ）的表達(dá)情況并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果癌組織中CD11c和MVD明顯高于癌旁組織（P＜0.01）；癌組織中MHC-Ⅱ明顯低于癌旁組織（P＜0.01）。MVD與MHC-Ⅱ呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.480，P＜0.01），而與CD11c則無(wú)明顯相關(guān)性。癌組織中各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移、TNM分期存在相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論肝癌組織中CD11c、MHC-Ⅱ的表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)；MVD的高表達(dá)與浸潤(rùn)性DCs的成熟度呈負(fù)相關(guān)性，提示增加DCs的成熟度可能成為肝癌抗血管治療的潛在靶點(diǎn)之一。

肝細(xì)胞癌；樹(shù)突狀細(xì)胞；腫瘤微血管；主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類(lèi)分子；免疫組化

肝細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其臨床病死率高，治療效果差，易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后的首要因素［1］。因肝癌是典型的多血管腫瘤，在其生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中離不開(kāi)腫瘤血管提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣。肝癌組織中微血管密度（microvascular density，MVD）直接反映了血管生成情況。樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）作為機(jī)體最強(qiáng)的一類(lèi)抗原提呈細(xì)胞，廣泛的分布于皮膚、黏膜、呼吸道、消化道等機(jī)體組織中，其最大特點(diǎn)是能有效地刺激靜息型T淋巴細(xì)胞、誘發(fā)初次免疫應(yīng)答的獨(dú)特功能，在機(jī)體抗腫瘤免疫中處于中心地位。DCs分為成熟DC（mature dendritic cell，mDC）和未成DC（immature dendritic cell，imDC）［2］。imDC能誘導(dǎo)免疫耐受，mDC可啟動(dòng)免疫應(yīng)答。該研究主要對(duì)DCs浸潤(rùn)數(shù)量、成熟情況與肝癌微血管密度的關(guān)系進(jìn)行探討。為肝癌的進(jìn)一步研究及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科2009年7月～2012年1月行外科手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的50例肝癌患者的癌組織及癌旁組織。上述患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。其中男41例，女9例；年齡30～79（58.41±10.13）歲。包膜完整者32例，不完整者18例；乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）陰性者12例，陽(yáng)性者38例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）：≤20 ng/ml者20例，＞20 ng/ml者30例；肝癌組織Edmondson分級(jí)：I～Ⅱ級(jí)29例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)21例；腫瘤轉(zhuǎn)移者25例，無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移者25例；按照2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（UICC/ AJCC）第七次修定的HCC TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)［3］：I～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期20例。以上材料得到患者及其患者家屬的書(shū)面同意和安徽醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑兔抗人單克隆抗體CD11c、主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類(lèi)分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHC-Ⅱ）（美國(guó)Abcam公司），鼠抗人單克隆抗體CD34mAb工作液、DAB、PBS、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1免疫組化染色 由CD11c和MHC-Ⅱ分別代表DCs與mDC的含量。常規(guī)石蠟包埋組織切片，制成厚3～4μm的連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化，按要求進(jìn)行抗原修復(fù)后，運(yùn)用抗生素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）進(jìn)行酶組織化學(xué)染色（一抗：兔抗人單克隆抗體CD11c，按1∶150稀釋?zhuān)煌每谷藛慰寺】贵wMHC-Ⅱ，按按1∶800稀釋?zhuān)?，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后用中性樹(shù)脂封片。采用PBS代替第一抗體作為陰形對(duì)照。結(jié)果判斷：采用雙盲法請(qǐng)兩位病理專(zhuān)家對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。CD11c定位于細(xì)胞膜上，以細(xì)胞膜染色見(jiàn)棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞；MHC-Ⅱ定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)上，出現(xiàn)棕褐色染色的細(xì)胞為MHC-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞；先在低倍鏡（×100）視野下觀看切片，隨機(jī)在癌組織和癌旁中選取5個(gè)具有代表性不重疊的區(qū)域，然后在高倍鏡（×200）下進(jìn)行計(jì)數(shù)，取這5個(gè)視野均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2微血管染色與計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 通過(guò)免疫組化染色方法計(jì)數(shù)50例患者肝癌組織內(nèi)的微血管。根據(jù)SP法，使用鼠抗人CD34抗體進(jìn)行免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下觀看到染色的區(qū)域即為腫瘤血管形成。MVD計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)按照Weidner［4］方法：對(duì)任何被染成棕褐色或棕黃的、分界清晰的內(nèi)皮或者內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)簇視為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，但是對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞個(gè)數(shù)大于8個(gè)時(shí)應(yīng)排除在外。先在低倍鏡（×100）下觀看整個(gè)切片，尋找到3個(gè)高血管密度區(qū)（即熱區(qū)），然后在高倍鏡（×200）下計(jì)數(shù)微血管數(shù)量。記錄這3個(gè)視野的微血管數(shù)量，取其平均值作為肝癌組織的MVD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)分析；相關(guān)分析使用Pearson相關(guān)分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色CD11c、MHC-Ⅱ、CD34在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示CD11c定位于細(xì)胞膜上，MHC-Ⅱ定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)上，兩者染色均為棕褐色。CD34標(biāo)記的MVD染色呈棕褐色或棕黃色。癌組織中CD11c和MVD表達(dá)為（31.10±5.39）、（47.40±15.85）個(gè)，明顯高于癌旁組織（25.68±4.60）、（16.28±7.37）個(gè)（P＜0.01）；癌組織中MHC-Ⅱ的表達(dá)為（13.34± 3.99）個(gè)，明顯低于癌旁組織（18.92±5.09）個(gè)（P＜0.01），見(jiàn)圖1、2。

2.2 肝癌組織中MVD與CD11c、MHC-Ⅱ表達(dá)的相關(guān)分析經(jīng)Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)，肝癌組織中MVD與MHC-Ⅱ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.480，P＜0.01），見(jiàn)圖3。MVD與CD11c無(wú)明顯相關(guān)性（r= 0.247），見(jiàn)圖4。

2.3 CD11c、MVD、MHC-Ⅱ在肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系肝癌組織中CD11c、MHC-Ⅱ的表達(dá)與肝癌有無(wú)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤包膜是否完整、肝硬化、Edmondson分級(jí)、AFP水平以及HBsAg等臨床病理特征無(wú)關(guān)；但MVD的表達(dá)與肝癌有無(wú)轉(zhuǎn)移、TNM分期、肝硬化、Edmondson分級(jí)、AFP水平等臨床病理特征有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

DCs作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，最大特點(diǎn)是唯一能夠激活靜息型T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。DCs在抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮著強(qiáng)大的免疫監(jiān)視功能。通過(guò)對(duì)大量實(shí)體腫瘤的研究［5-6］也表明患者的預(yù)后與DCs的浸潤(rùn)程度有關(guān)，腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的DCs的數(shù)量越多則患者的預(yù)后越好。在大多數(shù)組織中，DCs以未成熟的形式出現(xiàn)，主要作用是捕獲抗原及加工處理。一旦imDC發(fā)現(xiàn)損傷或者病原體相關(guān)分子存在時(shí)，便開(kāi)始進(jìn)入成熟狀態(tài)［7］。當(dāng)DCs進(jìn)入成熟狀態(tài)后，其就會(huì)喪失捕獲抗原的能力，轉(zhuǎn)化為抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），并在召集初始T細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答上發(fā)揮主要作用。隨著DCs的成熟，其表面分子標(biāo)志也隨之發(fā)生變化，mDC表面主要表達(dá)大量的MHC-Ⅱ、共刺激分子B7、黏附分子（ICAM-1）以及各種刺激T淋巴細(xì)胞相關(guān)反應(yīng)的共刺激分子；而imDC低表達(dá)這些分子，并可以介導(dǎo)免疫耐受［8-9］。CD11c是目前最常用的DCs標(biāo)志物之一，mDC和imDC均可以表達(dá)該分子［10］。迅速生長(zhǎng)的腫瘤通過(guò)召集DCs并促使IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、類(lèi)前列腺素等釋放阻止DCs的分化、成熟及其體內(nèi)外其他的功能［11］。本研究使用CD11c和MHC-Ⅱ來(lái)檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織中DCs與mDC的含量，結(jié)果提示肝癌組織中CD11c的陽(yáng)性個(gè)數(shù)顯著高于癌旁組織，而MHC-Ⅱ的陽(yáng)性個(gè)數(shù)明顯低于癌旁組織。提示癌組織中DCs的含量高于癌旁組織，而有抗原提呈能力的mDC含量相對(duì)于癌旁組織減少，推測(cè)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)、增殖的原因之一。

腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為離不開(kāi)豐富的血管網(wǎng)提供的營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣。作為多血管腫瘤，肝癌有生長(zhǎng)快、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。尋其原因，腫瘤微血管生成在其上述惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著不可或缺的作用［12］。因此，抗腫瘤血管生成已成為有效的抗腫瘤方法之一。由于血管生成是腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生的多種促血管因子和抑血管因子雙重調(diào)控的結(jié)果。MVD可以直接反映血管生成情況，CD34抗體是區(qū)分肝癌與良性腫瘤的最好指標(biāo)［13］。為了進(jìn)一步了解MVD與CD11c、MHC-Ⅱ的關(guān)系，本研究用了特異性最高的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34進(jìn)行研究，顯示肝癌癌組織中的MVD值明顯高表達(dá)于癌旁組織，說(shuō)明癌組織中新生血管的活力要明顯高于癌旁組織，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；癌組織中MVD與CD11c無(wú)明顯相關(guān)性，與MHC-Ⅱ成呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。即表明MVD與組織中浸潤(rùn)mDC數(shù)量成負(fù)性相關(guān)關(guān)系，與總DCs的含量無(wú)關(guān)。說(shuō)明腫瘤血管的生成受DCs成熟情況的影響。這是因?yàn)閕mDC能夠以一種特殊的形式進(jìn)入血管壁并定植于血管周?chē)?，支持血管的?gòu)成［14］；而且還能通過(guò)產(chǎn)生一些旁分泌信號(hào)（如IL-8，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）有利于血管的生成、構(gòu)造及成形，并分化誘導(dǎo)血管內(nèi)細(xì)胞的定植，促使腫瘤血管的生長(zhǎng)、發(fā)展及成熟。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)顯示肝癌組織中DCs、MVD的含量明顯高于癌旁組織，而mDC的含量低于癌旁組織，MVD與mDC之間存在負(fù)相關(guān)性；并且腫瘤有無(wú)轉(zhuǎn)移及TNM分期也影響這些指標(biāo)的表達(dá)。即表明腫瘤的微環(huán)境（腫瘤內(nèi)血管形成和局部免疫反應(yīng)）影響肝癌患者的預(yù)后。目前相關(guān)研究［15］證實(shí)阻止新生血管的生成后，實(shí)體腫瘤組織中細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡達(dá)到相對(duì)平衡，腫瘤便進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，不會(huì)生長(zhǎng)成為臨床上可見(jiàn)的腫瘤。因此，遏制腫瘤新生血管的生成也就阻止了腫瘤的生長(zhǎng)，但是由于細(xì)胞因子之間以及細(xì)胞免疫系統(tǒng)與腫瘤之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，對(duì)某些因素進(jìn)行單獨(dú)處理，往往不能取得滿意的結(jié)果。本研究提示在采用現(xiàn)階段肝癌治療手段的同時(shí)結(jié)合有選擇性的應(yīng)用DCs進(jìn)行免疫治療、抗血管生成治療，可阻止肝癌的生長(zhǎng)、增殖。因此，對(duì)腫瘤組織浸潤(rùn)DCs成熟度的干預(yù)可能成為肝癌抗血管治療的潛在靶點(diǎn)之一。

［1］ Forner A，Llovet JM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma［J］. Lancet，2012，379（9822）：1245-55.

［2］ 豐 帆，徐光輝，同李平，等.樹(shù)突狀細(xì)胞與胃癌研究進(jìn)展［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（01）：99-101.

［3］ Edge SB，Compton CC.The American Joint Committee on Cancer：the 7th edition of the AJCC cancer stagingmanual and the future of TNM［J］.Ann Surg Oncol，2010，17（6）：1471-4.

［4］ Weidner N.Current pathologicmethods formeasuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36（2）：169-80.

［5］ Iwamoto M，Shinohara H，Miyamoto A，et al.Prognostic value of tumor-infiltrating dendritic cells expressing CD83 in human breast carcinomas［J］.Int JCancer，2003，104（1）：92-7.

［6］ Schwaab T，Weiss JE，Schned A R，etal.Dendritic cell infiltration in colon cancer［J］.JImmunother，2001，24（2）：130-7.

［7］ Dai F Z，Yang J，Chen X B，etal.Zinc finger protein A20 inhibitsmaturation of dendritic cells resident in rat liver allograft［J］.J Surg Res，2013，183（2）：885-93.

［8］ Yin W，Ouyang S，Li Y，et al.Immature dendritic cell-derived exosomes：a promise subcellular vaccine for autoimmunity［J］.Inflammation，2013，36（1）：232-40.

［9］ 王正昕，張明徽，李 楠，等.胃癌組織中樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)及其表面分子表達(dá)的臨床意義［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23（3）：264-6.

［10］Stefanovic S，Schuetz F，Sohn C，et al.Bonemarrow microenvironment in cancer patients：immunological aspects and clinical implications［J］.Cancer Metastasis Rev，2013，32（1-2）：163-78.

［11］Bellail A C，Olson J J，Yang X，etal.A20ubiquitin ligase-mediated polyubiquitination of RIP1 inhibits caspase-8 cleavage and TRAIL-induced apoptosis in glioblastoma［J］.Cancer Discov，2012，2（2）：140-55.

［12］Bishayee A，Darvesh A S.Angiogenesis in hepatocellular carcinoma：a potential target for chemoprevention and therapy［J］.Curr Cancer Drug Targets，2012，12（9）：1095-118.

［13］Poon R T，Ng IO，Lau C，et al.Tumormicrovessel density as a predictor of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma：a prospective study［J］.JClin Oncol，2002，20（7）：1775-85.

［14］Nakai K，F(xiàn)ainaru O，Bazinet L，et al.Dendritic cells augment choroidal neovascularization［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49（8）：3666-70.

［15］Naumov G N，Bender E，ZurakowskiD，etal.A model of human tumor dormancy：an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype［J］.JNatl Cancer Inst，2006，98（5）：316-25.

Expression of CD11c and MHC-Ⅱin hepatocellular carcinoma and any association w ith tumor angiogenesis

Zhang Nannan，Shi Hai，Xu Jianming，et al
（Deptof Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore the expression of the number and maturation of DCs inhepatocellular carcinoma（HCC）tissues and any association with tumormicrovascular density（MVD）.MethodsFifty cases of HCC tumor andparacarcinomatous tissueswere collected.Immunohistochemistry methods was used to detect the expressions of CD11c，CD34，and major histocompatibility complex classⅡ（MHC-Ⅱ）to analyze the correlation among them.ResultsCD11c，MVD in HCC tissueswas higher than that in the surrounding tissues.The MHC-ⅡinHCC tissueswas significantly lower than that in the surrounding tissues.There was a negative correlation between the MVD value and the expression of MHC-Ⅱ（r=-0.480，P＜0.01）；there was no correlation between the MVD and the expression of CD11c.The expressions of CD11c and MHC-Ⅱin HCC tissues were related to HCC metastasis and TNM classification（P＜0.05）.ConclusionIn HCC tissues，The expressions of CD11c and MHC-Ⅱwere related to HCCmetastasisand TNM classification；The higher expressions of MVD was a negative correlation with MHC-Ⅱ，which indicate that the increase ofmaturation of DCsmaybe come one of the potential targets anti-angiogenesis therapy of HCC.

hepatocellular carcinoma cell；dendritic cells；major histocompatibility complex classⅡ；tumor microvessel density；immunohistocemistry

R 735.7

A

1000-1492（2016）03-0388-05

時(shí)間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.034.html

2015-12-08接收

安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：1308085MH147）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230022

張楠楠，女，碩士研究生；

石 海，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shmdah@163.com