腐植酸對石油污染土壤特性和生物修復(fù)效果的影響

張秀霞，韓雨彤，張　涵，丁　崢

(中國石油大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 環(huán)境與安全工程系, 山東 青島 266580)

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腐植酸對石油污染土壤特性和生物修復(fù)效果的影響

張秀霞，韓雨彤，張涵，丁崢

(中國石油大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 環(huán)境與安全工程系, 山東 青島 266580)

摘要：為研究腐植酸對石油污染土壤生物修復(fù)的影響，考察了不同腐植酸含量對石油污染土壤特性以及在低含水條件下對石油污染土壤土著微生物修復(fù)效果的影響，探究了腐植酸在干旱少降水地區(qū)修復(fù)石油污染土壤的可行性。結(jié)果表明，土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時有利于調(diào)節(jié)土壤的C/N質(zhì)量比，有利于土著微生物對速效磷的利用，土著微生物酶活性比對照土壤樣品有顯著提高；在低含水率條件下，腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g土壤樣品的30 d石油烴降解率達到27.7%，而對照土壤樣品只有5.9%。

關(guān)鍵詞：石油污染土壤；腐植酸含量；降解率；含水率；土著微生物；酶活性

石油污染土壤危害極大[1-3]，其治理勢在必行。目前，治理石油污染的方法主要有物理法、化學(xué)法以及生物法，其中生物法的研究較為廣泛[4-5]。微生物可將石油烴作為生長所需的碳源和能源進行代謝活動[6]，但其需要適合的pH值、水分和養(yǎng)分等條件[7]。然而，很多石油污染土壤并不具備這些條件，尤其是新疆、西北等干旱缺水地區(qū)，缺少微生物生長最需要的水分。因此，有必要針對這類地區(qū)石油污染土壤的生物修復(fù)給予一些改進措施。

腐植酸，又稱胡敏酸，按其形成的理化途徑可分為礦物腐植酸和生化腐植酸。其中，后者系由農(nóng)業(yè)廢物通過微生物發(fā)酵工藝而制得，含有豐富的黃腐酸，還有氨基酸和多種微生物群，施入土壤后可以改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，增強土壤吸水量和透氣性，且不會造成次生污染，堪稱現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的綠色精靈[8]。與其他化學(xué)土壤改良劑相比，腐植酸具有很高的反應(yīng)活性，能夠與環(huán)境中的多種有毒活性污染物發(fā)生作用[9]，從而起到減緩環(huán)境污染的作用。此外，研究表明[10]，腐植酸可強化微生物對有機污染物的降解性能，更有效地發(fā)揮高效降解菌的降解能力。因此，筆者選用腐植酸作為土壤改良劑，應(yīng)用于土壤生物修復(fù)中。

筆者向石油污染土壤中加入不同質(zhì)量生化腐植酸，以調(diào)節(jié)土壤腐植酸濃度，考察腐植酸含量對石油污染土壤含水率、C/N質(zhì)量比、速效磷含量、脫氫酶活性、多酚氧化酶活性和過氧化氫酶活性的影響；研究腐植酸含量在低含水條件下對石油污染土壤修復(fù)效果的影響，為降水量少、長久干旱地區(qū)的石油污染土壤的治理提供理論依據(jù)。

1實驗部分

1.1　實驗土壤

實驗土壤采自新疆油田某鉆井作業(yè)區(qū)附近石油污染土壤。該土壤質(zhì)地為砂質(zhì)黏壤土，外觀呈淺黑色，有油味，較干燥，理化性質(zhì)列于表1。采后土壤于通風(fēng)處風(fēng)干、破碎、過篩，取60~80目者進行實驗，使用前低溫冷凍保存。

表1　石油污染土壤理化性質(zhì)

1.2　儀器和材料

上海秣馬恒溫設(shè)備廠HSX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱；上海合利儀器有限公司UV-6000PC型紫外分光光度計；昆山市超聲儀器有限公司KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗儀；無錫市瑞江分析儀器有限公司RJ-TDL-5A型低速臺式大容量離心機；上海洪紀儀器設(shè)備有限公司ATN-300型全自動定氮儀；上海洪紀儀器設(shè)備公司KDN-08C 型消化爐。

生化腐植酸，AR，天津市光復(fù)精細化工研究所產(chǎn)品，其組成為w(C)=46.6%、w(N)=3.9%、w(H)=4.9%、w(O)=26.3%、w(Ash)=10%、w(Moisture)<8%、w(Fe)≤0.3%。

1.3　實驗方法

在10個培養(yǎng)皿中分別加入100 g 60~80目實驗土壤(每2個為一組平行樣品)。然后加入不同含量腐植酸使土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)分別為0、10、50、100、150 mg/g，不加腐植酸的為對照組土壤樣品。在溫度28℃、空氣濕度50%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。利用土著微生物進行生物修復(fù)，每隔6 d取樣，分別測定土壤含水率，石油烴、有機碳、全氮、速效磷含量以及多酚氧化酶、脫氫酶和過氧化氫酶含量。每個平行樣品取3個樣品進行各項指標(biāo)測定，取均值為測定結(jié)果。

1.4　測定和計算方法

1.4.1測定方法

采用烘干稱重法測定土壤含水率[11]；采用超聲提取-紫外分光光度法測定土壤石油烴含量[12]；采用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定土壤有機碳含量；采用半微量凱式法測定土壤全氮含量；采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量[13]；采用鄰苯三酚(焦性沒食子素)比色法測定多酚氧化酶含量；采用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(TTC)還原法測定脫氫酶含量；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶含量[14]。

1.4.2計算方法

焚燒處理因減容效果良好、消毒徹底、有利于實現(xiàn)城市垃圾資源化，而成為全世界垃圾處理的最主要模式。我國的城市垃圾焚燒處理率也在逐年升高，預(yù)計到2020年，我國垃圾焚燒處理率將達到50%。但生活垃圾焚燒后會產(chǎn)生大量的固體殘渣，主要包括底灰和飛灰。飛灰是指在煙氣凈化系統(tǒng)和熱回收系統(tǒng)中收集得到的殘留物，占焚燒灰渣總量的10%～20%左右。通過焚燒，生活垃圾中33%的Pb、92%的Cd以及45%的Sb都遷移到了飛灰之中，因此垃圾焚燒飛灰中富集了大量的重金屬。

從土壤的有機碳、全氮含量按式(1)計算得出土壤C/N質(zhì)量比(m(C)/m(N))。

(1)

式(1)中，w(Organic matter)為土壤有機碳質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；w(Total nitrogen) 為土壤總氮質(zhì)量分數(shù)，mg/kg。

從降解前后的石油烴含量按式(2)計算得出石油烴降解率。

(2)

式(2)中，η為石油烴降解率；w0、w1分別為修復(fù)nd前后土壤的石油烴質(zhì)量分數(shù)，mg/kg。

2結(jié)果與討論

2.1　腐植酸對土壤含水率的影響

圖1為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤含水率的影響。由圖1可以看出，在空氣濕度50%下，土壤樣品持水性隨其腐植酸含量的增大而增大。這是由于腐植酸結(jié)構(gòu)中有許多大小不一的孔洞、孔隙，可以改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，增強土壤吸水量和透氣性，起到一定的蓄水作用[8]。由于微生物的生命活性在一定程度上依賴于生存環(huán)境中的水分，土壤中加入適量腐植酸，可增強土壤蓄水性，在有限空氣濕度下吸收空氣中少量水分，并貯存于土壤孔隙中，可為微生物的生長提供必要的水分，進而提高生物修復(fù)效果。

圖1　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤含水率(w(Moisture))的影響

2.2　腐植酸對石油污染土壤修復(fù)效果的影響

圖2為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤石油烴降解率的影響。由圖2可以看出，各土壤樣品石油烴降解率曲線整體趨勢相似。第0~12 d的降解率較小，說明降解原油微生物在實驗中第0~12 d處于對新碳源的適應(yīng)階段；第12~24 d時微生物以原油為碳源，處于生長的對數(shù)階段，降解率迅速上升；第24~30 d的降解率仍然呈上升狀態(tài)，但變化減緩，這是因為碳源不足，土壤微生物生長速率減緩之故。對照土壤樣品的30 d石油烴降解率為5.9%，而土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，石油烴降解率最佳，達到27.7%，說明適宜含量腐植酸的加入，有利于可降解石油烴的土著微生物作用，但修復(fù)效果并不是隨腐植酸含量升高而無限提高。腐植酸施入量與土壤質(zhì)量存在最佳比例，若超出此最佳值，多施入的腐植酸可能會造成土壤中營養(yǎng)比例的失衡，反而不利于土著微生物的生長。因此，土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，修復(fù)效果最佳。

圖2　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤石油烴降解率(η)的影響

2.3　腐植酸對土壤m(xù)(C)/m(N)的影響

圖3為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤m(xù)(C)/m(N)的影響。由圖3可以看出，未加入腐植酸的對照土壤樣品在20 d后m(C)/m(N)顯著增高。這是由于土壤中的石油烴會影響土壤有機質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，使土壤m(xù)(C)/m(N)發(fā)生變化，進而對土壤中微生物群落和區(qū)系產(chǎn)生不利影響[15]，且石油污染物破壞了氮循環(huán)相關(guān)菌落結(jié)構(gòu)，而氮循環(huán)相關(guān)功能微生物在土壤發(fā)揮其生態(tài)功能中起著重要的作用[16-17]。腐植酸可為土壤提供一定量碳源，又可促進氮的吸收[18]，因此可起到調(diào)節(jié)土壤m(xù)(C)/m(N)的作用。土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，其m(C)/m(N)基本維持在6.5左右，最有利于降解石油烴的土著微生物利用[19]。

圖3　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤m(xù)(C)/m(N)的影響

2.4　腐植酸對土壤速效磷含量的影響

圖4為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤速效磷質(zhì)量分數(shù)的影響。由圖4可以看出，土壤速效磷含量在第0~12 d呈增長趨勢，且土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時速效磷含量增長量最大。這是由于腐植酸可減少土壤對可溶性磷的固定，通常土壤中Ca3(PO4)2很難溶于水，而加入腐植酸發(fā)生反應(yīng)后所形成的磷酸氫鹽和磷酸二氫鹽都溶于水[20]，易被土著微生物吸收利用。在第12 d后，由于降解石油烴的土著微生物處于增長期，需要利用速效磷作為營養(yǎng)物質(zhì)，速效磷含量開始呈現(xiàn)減少趨勢，第12~24 d下降趨勢明顯，第24~3 0 d仍然呈減少狀態(tài)，但變化減緩。這與石油烴降解率變化趨勢相符，說明適宜含量腐植酸的加入可促進降解石油烴的土著微生物生長繁殖。

圖4　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤速效磷質(zhì)量分數(shù)的影響

2.5　腐植酸對土壤多酚氧化酶活性的影響

圖5為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤多酚氧化酶活性的影響。由圖5可以看出，各土壤樣品的多酚氧化酶活性(以多酚氧化酶含量表示，脫氫酶、過氧化氫酶亦類同)均有增加，尤以腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100、50 mg/g的土壤樣品增幅最大。在石油污染土壤修復(fù)過程中不斷產(chǎn)生酚類物質(zhì)促進微生物形成多酚氧化酶，后者可以將土壤中的芳香族化合物氧化成醌，進而與土壤中的蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)反應(yīng)生成相對分子質(zhì)量大小不同的有機質(zhì)和色素，完成土壤芳香族化合物的循環(huán)[21]。由于實驗所選用土壤結(jié)構(gòu)較差，修復(fù)初期各土壤樣品中多酚氧化酶較少，加入不同質(zhì)量腐植酸，多酚氧化酶含量均呈增長趨勢，以腐植酸質(zhì)量分數(shù)100、50 mg/g效果最佳。這說明適宜含量腐植酸的加入有助于石油污染土壤中多酚氧化酶的生成，進而有利于石油污染土壤中土著微生物進行生物修復(fù)。

圖5　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤多酚氧化酶活性的影響

2.6　腐植酸對土壤脫氫酶活性的影響

微生物對石油烴的降解或轉(zhuǎn)化從脫氫開始，在氫的中間轉(zhuǎn)化中起傳遞作用。脫氫酶能夠促進脫氫反應(yīng)，可起到氫的中間傳遞體的作用[22]，因此脫氫酶活性可以作為評價微生物降解石油烴能力的一種指標(biāo)。圖6為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤脫氫酶活性的影響。由圖6可以看出，各土壤樣品的脫氫酶活性在第0~12 d增長較緩慢，在第12~18 d內(nèi)有顯著增長，且腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時土壤樣品的脫氫酶活性增長最大，在第18 d后，脫氫酶活性降低，脫氫酶活性與石油烴降解率變化趨勢基本相同。結(jié)合圖2可以得出，在石油污染土壤修復(fù)初期，由于土著微生物不適應(yīng)剛加入外來營養(yǎng)物質(zhì)的新環(huán)境，不能分泌大量的土壤酶，導(dǎo)致脫氫酶活性變化不明顯；在修復(fù)第12~18 d，脫氫酶活性增加迅速，說明土壤微生物新陳代謝增強，脫氫酶大量分泌；第18 d后各種土壤樣品的脫氫酶活性呈下降趨勢，是由于土著微生物在降解石油烴過程中產(chǎn)生的難降解物質(zhì)積累，有毒代謝產(chǎn)物增加，從而抑制了脫氫酶的產(chǎn)生所致。土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，脫氫酶含量可增至最大值，這可能是由于適宜含量腐植酸的加入，其富含的多種含氧功能團和氨基酸功能團與難降解物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進而減少了土著微生物修復(fù)時產(chǎn)生的難降解物質(zhì)的毒害作用。

圖6　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤脫氫酶活性的影響

2.7　腐植酸對土壤過氧化氫酶活性的影響

圖7為腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤過氧化氫酶活性的影響。由圖7可以看出，在修復(fù)過程中，過氧化氫酶活性均大致呈增長趨勢。過氧化氫酶能促進H2O2分解生成O2和H2O，防止H2O2在土壤中的積累對生物體產(chǎn)生毒害作用，并且還與土壤呼吸作用和微生物活動息息相關(guān)[21]。過氧化氫酶生長變化情況，可側(cè)面反映石油污染土壤在修復(fù)過程中有毒物質(zhì)積累情況。在土著微生物修復(fù)的第6~24 d，相對其他土壤樣品來說，腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g土壤樣品的過氧化氫酶活性最大，為0.92 mg/(g·h)，也就是說其有毒物質(zhì)積累較少，可促進微生物的呼吸作用，增加微生物對土壤H2O2的分解，促進過氧化氫酶的分泌。

圖7　腐植酸質(zhì)量分數(shù)對土壤過氧化氫酶活性的影響

3結(jié)論

(1) 在含水率較低的石油污染土壤中，腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，有利于調(diào)節(jié)石油污染土壤的C/N質(zhì)量比，且有助于土壤中速效磷含量的增加，可促進降解石油烴微生物的生長繁殖。

(2) 石油污染土壤腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，有助于其中多酚氧化酶的生成，進而促進土壤完成芳香族化合物的循環(huán)。在土壤修復(fù)初期，可促進脫氫酶的產(chǎn)生，有助于脫氫反應(yīng)的進行。在修復(fù)過程中過氧化氫酶活性增長量最大，可促進微生物的呼吸作用，增加微生物對土壤H2O2的分解，促進過氧化氫酶的分泌，減少修復(fù)過程中有毒物質(zhì)的積累。

(3) 土樣腐植酸質(zhì)量分數(shù)為100 mg/g時，30 d石油烴降解率最高，可達到27.7%，而對照土壤樣品只有5.9%。說明適宜含量腐植酸的加入，有助于低含水率條件下石油污染土壤修復(fù)的進行，可為干旱少降水地區(qū)此類土壤的修復(fù)提供一條可行的途徑。

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Influence of Humic Acid on the Soil Characteristics and Bio-Remediation of Oil-Contaminated Soil

ZHANG Xiuxia, HAN Yutong, ZHANG Han, DING Zheng

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityof

Petroleum,Qingdao266580,China)

Abstract：In order to study the influence of humic acid in the process of oil-contaminated soil bio-remediation, the effects of humic acid with different concentrations on the characteristics and bioremediation of oil-contaminated soil under low water content condition were investigated, and the feasibility of humic acid in the oil-contaminated soil bioremediation in the arid regions was explored. The experimental results showed that the addition of humic acid with mass fraction of 100 mg/g could help to balance the mass ratio of carbon to nitrogen (m(C)/m(N)) in oil-contaminated soil, and was in favor of the indigenous microbial utilization of available phosphorus, so the indigenous microorganism enzymatic activity increased significantly than that in the control soil samples. Under the conditions of low moisture content, the hydrocarbon degradation rate of the oil-contaminated soil sample adding humic acid of mass fraction 100 mg/g was 27.7% in 30 d, while that of the control soil samples was 5.9%.

Key words：oil-contaminated soil; humic acid content; degradation rate; water content; indigenous microorganism; enzyme activity

中圖分類號：TE991.3

文獻標(biāo)識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1001-8719.2016.01.022

文章編號：1001-8719(2016)01-0164-06

基金項目：山東省自然科學(xué)基金(ZR2014BM023)、中國石油科技創(chuàng)新基金(2009D-5006-07-01)、青島市科技發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(KJZD-12-65-jch)、中央直屬高?？蒲袑ｍ椈?11CX05011A)、中國石油大學(xué)(華東)研究生創(chuàng)新工程(CX-1219及CX2013035)、研究生金點子項目(JDZ1405030)和創(chuàng)新基金實驗項目(14CX06101A)資助

收稿日期：2014-07-28

通訊聯(lián)系人： 張秀霞，女，教授，博士，從事石油污染土壤修復(fù)研究；E-mail：zhxiuxia@upc.edu.cn