時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物優(yōu)越性的探討

巢浩界 張銘

臨床研究

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物優(yōu)越性的探討

巢浩界 張銘

目的建立時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物5項(xiàng)指標(biāo)的方法，并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行比較分析。評(píng)價(jià)TRFIA的性能，以期提高乙肝病毒標(biāo)志物定量檢測(cè)的診斷價(jià)值。方法收集329 份血清標(biāo)本，用TRFIA檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物，并與ELISA檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果兩種方法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物的結(jié)果一致率較好〔乙肝表面抗原(HBsAg) 為99.4%，乙肝表面抗體(HBsAb)為98.8%，乙肝E抗原(HBeAg)為99.1%，乙肝E抗體(HBeAb)為98.2%，乙肝核心抗體(HBcAb)為97.6%〕;TRFIA陽(yáng)性檢出率大于ELISA(HBsAg:90比88，HBsAb: 115比111，HBeAg:45比42，HBeAb:211比205，HBcAb:246比238，P均＜ 0.05)。TRFIA的 敏感度和特異度均優(yōu)于ELISA(敏感度:97.80%比91.21%，特異度:99.58%比97.89%，P均＜ 0.05); TRFIA的批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)均優(yōu)于ELISA(批內(nèi)CV:3.19%比5.99%，批間CV:4.68%比7.55%，P均＜ 0.05)。結(jié)論TRFIA作為一項(xiàng)具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物技術(shù)，對(duì)乙肝病毒標(biāo)志物的檢測(cè)效能高于ELISA。

時(shí)間分辨熒光免疫分析法;乙肝病毒標(biāo)志物;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

20世紀(jì)70年代芬蘭科學(xué)家Soini和Hemmia首先引入了“時(shí)間分辨熒光免疫分析”的概念。基于放射性免疫分析技術(shù)具有放射性污染的缺點(diǎn)，20世紀(jì)80年代Soini和Kojola發(fā)明了時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)［1-2］，有別于傳統(tǒng)的熒光免疫分析技術(shù)，這是一種將熒光物質(zhì)和時(shí)間分辨技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，其基本原理是用銪(Eu3+)、鋱(Te3+)及釤(Sm3+)、鏑(De3+)等示蹤物來標(biāo)記抗原抗體、多肽、激素、核酸探針等微量物質(zhì)，形成鑭系元素標(biāo)記的抗原抗體結(jié)合物，最后待背景上的短壽命熒光完全淬滅后，再測(cè)量產(chǎn)物上的長(zhǎng)壽命熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值得出最終的結(jié)果［3］。時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)分別以不同的波長(zhǎng)且分時(shí)間段測(cè)量標(biāo)記物上的熒光強(qiáng)度，利用發(fā)射光和激發(fā)光之間的Stokes位移可以有效地消除標(biāo)本中的非特異熒光物質(zhì)的干擾，最常用的示蹤物為鑭系元素，以此來標(biāo)記抗原、抗體，具有制備簡(jiǎn)單、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、線形范圍寬、高敏感度、特異度、對(duì)多種被檢物質(zhì)同時(shí)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)對(duì)本院采用該方法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物的優(yōu)越性進(jìn)行探討，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器 Anytest2000型時(shí)間分辨儀由新波公司生產(chǎn);運(yùn)用伯樂洗板機(jī)洗板及伯樂酶標(biāo)儀，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑由珠海麗珠試劑有限公司提供。

1.2 標(biāo)本來源 隨即選取2015年1月至5月常州市婦幼保健院婦科和產(chǎn)科住院患者共329例，靜脈采血，分離血清，-20℃保存。乙肝病毒血清標(biāo)志物質(zhì)控品購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，批號(hào)090040。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用ELISA定性檢測(cè)和時(shí)間分辨免疫熒光法(TRFIA)定量檢測(cè)329份血清標(biāo)本和質(zhì)控樣品的的乙肝兩對(duì)半。

1.4 結(jié)果判斷 TRFIA的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為乙肝表面抗原(HBsAg)≥0.2 μg/L、乙肝表面抗體(HBsAb) ≥10 U/L、乙肝E抗原(HBeAg)≥0.5 PEIU/mL、乙肝E抗體(HBeAb)≥0.2 PEIU/mL、乙肝核心抗體(HBcAb)≥0.9 PEIU/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)全部采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;采用χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料分析;P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRFIA和ELISA檢測(cè)329份血清標(biāo)本的結(jié)果

兩種方法測(cè)定標(biāo)本HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的結(jié)果符合率經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜ 0.05)。見表1。

表1 TRFIA和ELISA檢測(cè)329份血清標(biāo)本乙肝兩對(duì)半的比較

TRFIA對(duì)乙肝病毒的檢出敏感度和特異度明顯優(yōu)于ELISA(P均＜ 0.05)。見表2。

表2 TRFIA和ELISA檢測(cè)乙肝病毒的敏感度和特異度比較

2.2 準(zhǔn)確度 將濃度為126.8 μg/L的HBsAg血清樣本分別加入到50、200、400 μg/L標(biāo)準(zhǔn)參考品中進(jìn)行回收試驗(yàn)。回收率分別為97.2%、96.5%、98.6%，平均97.4%。

2.3 精密度 隨機(jī)選取高、中、低值3份混合血清樣品HBsAg 濃度分別為35.5、264.3、659.7 μg/L)，按操作步驟操作，20孔平行測(cè)定，TRFIA批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別平均為3.19%和4.68%，均優(yōu)于ELISA(P均＜ 0.05)。見表3～4。

表3 HBsAg 批內(nèi)精密度測(cè)試(n = 20)

表4 HBsAg 批間精密度測(cè)試(n = 20)

2.5 靈敏度 重復(fù)測(cè)定陰性標(biāo)本20次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差，也就是所能檢測(cè)的最低抗原濃度。ELISA的最低檢出濃度為5 μg/L，TRFIA 為0.5 μg/L。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果明顯可以看出，兩種方法檢測(cè)乙肝病毒兩對(duì)半的結(jié)果一致率較好，但TRFIA陽(yáng)性檢出率和敏感度均大于ELISA，可以減少一些極低濃度HBsAg、HBeAg患者的假陰性率。

TRFIA具有很高的穩(wěn)定性和靈敏度，近年來在國(guó)內(nèi)外得到廣泛的認(rèn)可，同時(shí)國(guó)內(nèi)多家公司在時(shí)間分辨技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的乙肝兩對(duì)半試劑，填補(bǔ)了我國(guó)檢驗(yàn)界在乙肝微量檢測(cè)方面的空白，是對(duì)乙肝標(biāo)志物微量檢測(cè)方面革命性的突破。有文獻(xiàn)表明，在很多乙肝病毒(HBV)感染的患者中，HBsAg呈低水平存在［4］，在血清中含量很低，不易檢出，很容易造成漏檢。目前，對(duì)HBsAg的檢測(cè)方法仍然普遍采用傳統(tǒng)的ELISA，這在一定程度上造成了相當(dāng)一部分HBsAg低水平的人群被大量漏檢。吳宗華等［5］針對(duì)大樣本非肝炎患者的檢測(cè)結(jié)果表明，HBsAg小于5 ng/mL以下者在檢測(cè)總?cè)巳汉完?yáng)性患者中的比例分別為2.34%和23.16%。通過TRFIA定量檢測(cè)“乙肝兩對(duì)半”發(fā)現(xiàn)，部分ELISA單項(xiàng)抗-HBc陽(yáng)性標(biāo)本用TRFIA能夠檢測(cè)出HBsAg。

TRFIA的優(yōu)越性體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先，急性乙肝早期，HBsAg含量極微，采用傳統(tǒng)酶法通常檢測(cè)不出;而TRFIA能及早檢出HBsAg，可以印證是否感染于HBV，減少窗口期時(shí)間。其二，在有些慢性乙肝患者中，分泌到血清中的HBsAg量極少，產(chǎn)生的HBsAb亦量少，采用一般的酶法檢測(cè)通常也為陰性;而TRFIA的高敏感性可以避免這種情況的發(fā)生，為臨床及時(shí)有效的診斷治療疾病提供了可靠的依據(jù)。其三，為其他肝病的鑒別診斷提供依據(jù)，如病毒性肝炎、酒精性肝炎等臨床癥狀、體征及肝功能極其相似，唯一的方法是找到病原體，才能有效的診斷疾病。因此，TRFIA定量檢測(cè)乙肝兩對(duì)半正逐步成為現(xiàn)代檢測(cè)乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物新的發(fā)展方向。

TRFIA極大地提高檢測(cè)分析的敏感性，因此在很多急性乙肝感染的早期或慢性乙肝患者中HBsAg往往小于2 μg/L，采用高靈敏度的TRFIA可以及時(shí)檢出HBsAg，佐證了HBV感染，且能夠同時(shí)檢測(cè)出乙肝病毒前S1抗原(perS1)，兩者相互印證［6］。在病程觀察中TRFIA能及早檢出HBsAg，印證HBV感染，減少窗口期時(shí)間;在病毒變異或低水平的二次感染時(shí)可以采用TRFIA檢測(cè)出血清中極微量的HBsAg和HBsAb。TRFIA定量檢測(cè)乙肝兩對(duì)半，可以動(dòng)態(tài)觀察病情并為臨床及時(shí)有效的診斷治療疾病提供可靠的依據(jù)。定量檢測(cè)HBsAg和HBsAb的濃度變化，可以診斷急性乙肝是否處于恢復(fù)期;定量檢測(cè)HBsAg和HBeAb的濃度變化，可以為病情變化和治療效果提供依據(jù);定量檢測(cè)HBcAb濃度的變化可以反映病毒感染的狀態(tài)及是否感染后處于恢復(fù)期。

判斷機(jī)體是否具有中和HBV感染的免疫力要看HBsAb的含量，ELISA可以檢測(cè)出來含量在10 U/L以上的樣本，呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，且ELISA只能夠作出陰陽(yáng)性的定性判斷;而TRFIA能夠精確檢測(cè)出HBsAb的含量［7］。定量檢測(cè)HBV表面抗原HbsAg濃度的最佳診斷臨界點(diǎn)是5.03×106U/L，超過臨界點(diǎn)的患者需要監(jiān)測(cè)并治療［8］。機(jī)體對(duì)HBV入侵的抵抗能力和保護(hù)時(shí)間與HBsAb含量呈正相關(guān)。對(duì)于HBsAb含量較低的人群，應(yīng)該加強(qiáng)注射一次乙肝疫苗，使 HBsAb的濃度提高起到預(yù)防作用。

TRFIA動(dòng)態(tài)、定量檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的抗原抗體陽(yáng)性模式能幫助臨床分析機(jī)體免疫反應(yīng)的機(jī)制，判斷臨床轉(zhuǎn)歸，及時(shí)預(yù)測(cè)耐藥病毒株的出現(xiàn)和監(jiān)測(cè)停藥反彈，對(duì)指導(dǎo)臨床治療能起到積極的指導(dǎo)作用。因此，TRFIA作為一項(xiàng)具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男屡d的生物技術(shù)，將會(huì)對(duì)臨床和科研產(chǎn)生更大的促進(jìn)作用。

1 Hemmil? I， Dakubu S， Mukkala VM， et al. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem，1984，137: 335-343.

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4 潘繼文.時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物評(píng)價(jià).檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8:3030-3031.

5 吳宗華. TRFIA與ELISA法檢測(cè)乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物的分析與比較.臨床醫(yī)學(xué)工程，2012，19:1967-1968.

6 劉榮靜，習(xí)浩，林列坤.乙型肝炎病毒表面抗原弱反應(yīng)性標(biāo)本的檢測(cè)及臨床意義.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7:404-405.

7 蔡軍，劉曉麗.時(shí)間分辨熒光免疫分析法測(cè)定乙肝HBsAg的臨床意義.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42:406-408.

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(本文編輯:李銀平)

Study on the superiority of hepatitis B virus markers detected by time resolved fluorescence immunoassay

CHAO Hao-jie, ZHANG Ming. Maternal and Child Care Service Centre in Changzhou, Changzhou 213000, Jiangsu, China

ObjectiveTo establish a method for the determination of 5 markers of hepatitis B virus by time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA) and compare the results with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . To evaluate the performance of TRFIA in order to improve the diagnostic value of quantitative detection of HBV markers .Methods329 serum samples were collected and TRFIA was used to detect HBV markers, and the results were compared with those of ELISA .ResultsThe results of the two methods for detection of HBV markers were in good agreement［Hepatitis B surface antigen (HBsAg) was 99.4%, Hepatitis B surface antibody (HBsAb) was 98.8%, Hepatitis B virus E antigen (HBeAg) was 99.1%, Hepatitis B virus E antibody (HBeAb) was 98.2%, Hepatitis B virus core antibody (HBcAb) was 97.6%］. The positive detection rate of TRFIA was higher than that of ELISA (HBsAg: 90 vs. 88, HBsAb: 115 vs. 111, HBeAg: 45 vs. 42, HBeAb: 211 vs. 205, HBcAb: 246 vs. 238, P all ＜ 0.05) . The sensitivity and specificity of TRFIA were better than ELISA (sensitivity: 97.80% vs. 91.21%, specificity: 99.58% vs. 97.89%, P all ＜ 0.05) . TRFIA was better than ELISA in batch and batch coefficient of variation (CV) in batch CV: 3.19% vs. 5.99%, batch CV: 4.68% vs. 7.55%, P all ＜ 0.05 .ConclusionTRFIA as a new biotechnology with great development potential , is more effective than ELISA in detecting HBV markers .

Time-resolved fluorescence immunoassay . Hepatitis B virus markers . enzyme-linked immunosorbent assay

213000 江蘇常州，常州市婦幼保健院

張銘，Email:zmzw0701@163.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2016.04.006

2016-10-20)