3種方法檢測白假絲酵母菌對氟康唑、伏立康唑的敏感性對比

陳文偉 黃良珍 彭鋼文

臨床研究

3種方法檢測白假絲酵母菌對氟康唑、伏立康唑的敏感性對比

陳文偉 黃良珍 彭鋼文

目的比較抗真菌藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法、ATB FUNGUS3(ATB F3)微量稀釋法和E-試驗(yàn)(Epsilometer test)檢測白假絲酵母菌對氟康唑、伏立康唑的結(jié)果，探討3種方法的可比性和一致性。方法使用紙片擴(kuò)散法和ATB F3法對中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院住院患者分離的58株白假絲酵母菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，同時(shí)用E-試驗(yàn)作為對照。結(jié)果紙片擴(kuò)散法與E-試驗(yàn)的符合率在氟康唑?yàn)?9.0%(40/58)，在伏立康唑?yàn)?8.2%(57/58);ATB F3法與E-試驗(yàn)的符合率在:氟康唑?yàn)?9.7%(52/58)，在伏立康唑?yàn)?6.6%(56/58)。結(jié)論紙片擴(kuò)散法檢測白假絲酵母菌對氟康唑敏感性與E-試驗(yàn)符合率不甚理想，ATB F3法比較理想;而伏立康唑無論紙片法還是ATB F3法與E-試驗(yàn)結(jié)果符合率非常一致。ATB F3法檢測白假絲酵母菌敏感性操作簡便，使用成本低，大多數(shù)醫(yī)院特別是基層醫(yī)院應(yīng)該推廣普及。

ATB FUNGUS3;E-試驗(yàn);抗真菌藥敏試驗(yàn)

雖然真菌感染是機(jī)會(huì)性感染性疾病，但威脅人類生命的真菌感染每年都在不斷地增多，其中念珠菌感染占了很大一部分比例［1］，并已成為醫(yī)院重癥加強(qiáng)治療病房(ICU)最嚴(yán)重的感染源之一［2］。由于廣譜抗菌藥物的長期和大量使用、血液透析及腫瘤化療藥物的使用，靜脈導(dǎo)管的介入治療及細(xì)胞免疫低下的人群不斷增多，導(dǎo)致真菌敗血癥的發(fā)病率逐漸增高［3］，國外有報(bào)道器官移植的患者念珠菌感染達(dá)到了3.5%［4］，對肝移植術(shù)后患者應(yīng)注意預(yù)防真菌感染［5］。氟康唑、伏立康唑均為臨床上應(yīng)用的比較多的抗真菌藥物，隨著抗真菌藥物的使用增多，耐藥率也在不斷地上升［6-7］，其中白假絲酵母菌在人體分離的念珠菌中占的比例達(dá)到了55.9%［8］，因此，其藥敏測試也顯得十分重要。本研究將紙片擴(kuò)散法、ATB FUNGUS3(ATB F3)法和E-試驗(yàn)(Epsilometer test)檢測白假絲酵母菌對氟康唑、伏立康唑敏感性結(jié)果進(jìn)行對比分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2015年1月至8月，從中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院各臨床科室住院患者的痰液、血液、中段尿及傷口分泌物等標(biāo)本中分離出的白假絲酵母菌58株(剔除同一患者同一部位連續(xù)分離的菌株，其中呼吸內(nèi)科20株、骨科6株、普外科5株、重癥監(jiān)護(hù)室18株、心腎神經(jīng)內(nèi)科9株)用于測試藥敏試驗(yàn)。

1.2 分離與鑒定 酵母菌分離采用沙保氏瓊脂平板28℃培養(yǎng)48 h;鑒定采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的API Candida鑒定分離菌株。

1.3 抗真菌藥敏試劑

1.3.1 藥敏紙片 由英國Oxoid公司生產(chǎn)。氟康唑每片25 μg，伏立康唑每片1 μg。

1.3.2 ATB F3試劑盒 由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)?？咕幬餄舛?氟康唑1～128 mg/L、伏立康唑0.06～8 mg/L。

1.3.3 E-試驗(yàn)試紙條 由瑞典AB-Biodisk公司生產(chǎn)，氟康唑0.016～256 mg/L、伏立康唑0.016～256 mg/L。藥敏培養(yǎng)基成分:RPMI 1640(由廣州迪景公司生產(chǎn))，0.165mol/L MOPS(由美國sigma公司生產(chǎn))，1.5%BACTO瓊脂(由美國DIFCO公司生產(chǎn))，2%葡萄糖121℃、15 min，制成直徑150 mm的平板。

1.4 方法

1.4.1 紙片擴(kuò)散法 將調(diào)好的0.5 mU白假絲酵母菌純菌液用棉拭子均勻徒布于改良SHADOMY瓊脂平板，將相應(yīng)紙片貼于平板培養(yǎng)18～24 h后讀結(jié)果，若菌落生長不良則再多培養(yǎng)24 h，在約80%抑制區(qū)判讀氟康唑的抑菌直徑，在100%抑制區(qū)讀取伏立康唑的抑菌直徑。

1.4.2 ATB F3法 將調(diào)好的2 mU白假絲酵母菌純菌液20 μL加入ATB F3培養(yǎng)基中混勻，再從每孔吸取135 μL混有菌液的培養(yǎng)基加入藥敏板中，置30℃孵育24～48 h。以生長對照孔生長良好，而含藥最高稀釋孔不生長者為最小抑菌濃度(MIC)的終點(diǎn)。

1.4.3 E-試驗(yàn) 將試驗(yàn)菌株用沙保氏瓊脂平板純化，挑起菌落溶于生理鹽水中，制備成濁度為0.5 mU的菌懸液。用無菌棉拭蘸取菌懸液，均勻涂布于藥敏專用培養(yǎng)基上，平板干燥15 min后將2種E-試驗(yàn)試紙條緊貼附于培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)24 h，在抑菌環(huán)與紙條上藥物濃度交界處下方讀取MIC值。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 紙片擴(kuò)散法 參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M51-A抗真菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。氟康唑:培養(yǎng)18～24 h，抑菌環(huán)直徑≥19 mm為敏感，15～18 mm為中介，≤14 mm為耐藥。伏立康唑:培養(yǎng)18～24 h，抑菌環(huán)直徑≥17 mm為敏感，14～16 mm為中介，≤13 mm為耐藥。

1.5.2 ATB F3法 參照CLSI M38-A2抗真菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):氟康唑≤8 mg/L、伏立康唑≤1 mg/L為敏感;氟康唑MIC≥64 mg/L、伏立康唑MIC≥4 mg/L為耐藥;氟康唑MIC在16～32 mg/L、伏立康唑MIC 在=2 mg/L為劑量依賴敏感或中介。

1.5.3 E-試驗(yàn) 參照CLSI M38-A2抗真菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):氟康唑≤8 mg/L、伏立康唑≤1 mg/L為敏感;氟康唑MIC≥64 mg/L、伏立康唑MIC≥4 mg/L為耐藥;氟康唑MIC在16～32 mg/L、伏立康唑MIC 在=2 mg/L為劑量依賴敏感或中介。

1.6 質(zhì)量控制 試驗(yàn)以白假絲酵母菌ATCC90028為對照同時(shí)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控紙片擴(kuò)散法 白假絲酵母菌ATCC90028對氟康唑和伏立康唑的抑菌環(huán)直徑為23 mm和22 mm均為敏感，質(zhì)控范圍來源于Oxoid公司提供的說明書。ATB F3法與E-試驗(yàn)檢測白假絲酵母菌ATCC90028對氟康唑的MIC分別為2 mg/L和1 mg/L，對伏立康唑的MIC分別為0.125 mg/L和0.125 mg/L。

2.2.1 紙片擴(kuò)散法與E-試驗(yàn)檢測白假絲酵母菌對氟康唑和伏立康唑的敏感性比較 紙片擴(kuò)散法檢測58株白假絲酵母菌，對氟康唑的敏感性敏感(S)為55.2%、依賴(SDD)為31.0%、耐藥(R)為13.8%; E-試驗(yàn)S為86.2%、SDD為10.4%、R為3.4%;對伏立康唑的敏感性S為91.3%、SDD為5.2%、R為3.4%;E-試驗(yàn)S為89.7%、SDD為6.9%、，R為3.4%。紙片擴(kuò)散法與E-試驗(yàn)藥敏結(jié)果符合率在氟康唑?yàn)?9.0%(40/58);在不符合的18株中，6株紙片擴(kuò)散法為SDD、E-試驗(yàn)為S，6株紙片擴(kuò)散法為R、E-試驗(yàn)為SDD。紙片擴(kuò)散法與E-試驗(yàn)藥敏結(jié)果符合率在伏立康唑98.2%(57/58);在不符合的1株中，紙片擴(kuò)散法為S，E-試驗(yàn)為SDD。見表1。

2.2.2 ATB F3法與E-試驗(yàn)檢測白假絲酵母菌對氟康唑和伏立康唑的敏感性比較 ATB F3法檢測58株白假絲酵母菌對氟康唑的敏感性S為75.9%、SDD為17.2%、R為6.9%;E-試驗(yàn)S為86.2%、SDD為10.4%、R為3.4%;ATB F3法對伏立康唑的敏感性為S為93.1%、SDD為5.2%、R為1.7%;ATB F3法與E-試驗(yàn)藥敏結(jié)果符合率在氟康唑?yàn)?9.7% (52/58);在不符合的6株中，2株ATB F3法為R、E-試驗(yàn)為SDD;4株ATB F3法為SDD、E-試驗(yàn)為S。伏立康唑符合率96.6%(56/58)，在不符合的2株中ATB F3法為S、E-試驗(yàn)為SDD。見表2。

表1 紙片擴(kuò)散法與E-試驗(yàn)檢測白假絲酵母菌的耐藥性比較

表2 ATB F3法與E-試驗(yàn)檢測白假絲酵母菌的耐藥性比較

3 討論

氟康唑?qū)儆谌蝾惪拐婢幬锞哂袕V譜的抗菌活性，毒性低，既可口服又可注射，適用于老人和兒童，是治療深部真菌感染的首選藥物。但隨著氟康唑使用增多的同時(shí)耐藥率也上升，新一代三唑類廣譜抗真菌藥物伏立康唑已經(jīng)上市。目前在全世界范圍的念珠菌耐藥的報(bào)道也在不斷地增多，當(dāng)中不乏報(bào)道有伏立康唑的耐藥。我國學(xué)者的研究表明，假絲酵母菌對氟康唑的耐藥在3.3%～42.3%［9］; Cuenca-Estrella等［10］在西班牙當(dāng)?shù)蒯t(yī)院分離的4 226株白假絲酵母菌對伏立康唑的耐藥率為5%，而伏立康唑在國內(nèi)耐藥則較少報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氟康唑?qū)Π准俳z酵母菌敏感性紙片擴(kuò)散法為55.2%，ATB F3法75.9%，參考對照E-試驗(yàn)為86.2%，紙片擴(kuò)散法與ATB F3法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)，伏立康唑紙片擴(kuò)散法和ATB F3法敏感性超過90%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞ 0.05)。

目前，我國紙片擴(kuò)散法、E-試驗(yàn)?zāi)钪榫乃幟粼囼?yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)是CLSI 2010年的CLSI M51-A［11］，微量稀釋法采用的標(biāo)準(zhǔn)是CLSI M38-A2［12］，其中CLSI紙片擴(kuò)散法操作簡便，但本試驗(yàn)顯示，紙片擴(kuò)散法測試氟康唑的敏感性與E-試驗(yàn)相比符合率不甚理想，而測試伏立康唑則與E-試驗(yàn)非常一致。ATB F3法操作簡單、判讀方便，成本相對較低，嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作即可得到合適濃度范圍內(nèi)的MIC

值，所以ATB F3法目前是我國應(yīng)用最廣的念珠菌藥敏測試的方法。但使用ATB F3法必須注意兩點(diǎn): ① ATB F3法試劑板上抗菌藥物濃度稀釋孔孔數(shù)比較少，由此得出的MIC值不如E-試驗(yàn)準(zhǔn)確，因而其檢測MIC折點(diǎn)值有一定誤差，對于區(qū)分SDD株和R株存在不足。② 在機(jī)器自動(dòng)判讀白假絲酵母菌的氟康唑和伏立康唑MIC折點(diǎn)值，如果存在拖尾現(xiàn)象時(shí)會(huì)將S或SDD讀成R，建議用人工肉眼判讀［13］。E-試驗(yàn)?zāi)壳笆亲罴训臏y試念珠菌藥敏的方法，它結(jié)合了擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，與肉湯稀釋法和微量稀釋法有良好的符合率［14］，判斷MIC折點(diǎn)值較準(zhǔn)確，但試紙條價(jià)格昂貴，目前臨床應(yīng)用受限而更多地用于科研。綜上所述，大多數(shù)醫(yī)院應(yīng)該普及ATB F3法測試白假絲酵母菌敏感性，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室得出的藥敏結(jié)果與臨床不符合或治療效果不佳時(shí)，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用E-試驗(yàn)復(fù)檢，更好地指導(dǎo)臨床用藥。

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(本文編輯:李銀平)

Comparative evaluation of three methods in susceptibility testing of fluconazole and voricanazole against candida albicans

CHEN Wen-wei, HUANG Liang-zhen, PENG Gang-wen. Department of Clinical Laboratory, Guzhen People's Hospital of Zhongshan , Zhongshan 528400 , Guangdong , China

ObjectiveTo compare white candida yeast susceptibility detection to fluconazole , voriconazole by Disc Diffusion and ATB FUNGUS3 (ATB F3) Micro-diffusion and Epsilometer test (E-test) method , discuss comparability and consistency of three methods .Methods58 strains white candida yeast isolated from hospitalized patients in Guzhen people's hospital were tested for drug sensitive by Disc Diffusion, ATB F3 method and as a control by the E-test method .ResultsThe accuracy of disc diffusion method and E-test method for fluconazole and voricanazole were 69.0% (40/58) and 98.2% (57/58) , respectively . The accuracy of ATB F3 method and E-test method for fluconazole and voricanazole were 89.7% (52/58) and 96.6% (56/58) , respectively .ConclusionsThere was not higher coincidence rate of Disc Diffusion method with E-test method for candida albicans susceptibility to fluconazole , the ATB F3 method was more ideal. There was highter coincidence rate with E-test method for voricanazole, no metter Disc Diffusion method or ATB F3 method . ATB F3 method promises to be easier and cheaper, ATB F3 method can be chosen as a primary hospital in widespread use testing method .

ATB FUNGUS3 . Epsilometer test . antifungal susceptibility

528400 廣東中山，中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

陳文偉，Email:401753338@qq.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2016.04.004

2016-06-27)