iPS細(xì)胞的研究進(jìn)展

隨蓓蓓

摘 要 本文內(nèi)容主要包括三個(gè)部分。第一部分，iPS細(xì)胞的定義、特征和醫(yī)用價(jià)值。第二部分， iPS細(xì)胞誘導(dǎo)因子和誘導(dǎo)方法。iPS細(xì)胞誘導(dǎo)基因主要有四個(gè)：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。Oct4和Sox2在誘導(dǎo)重構(gòu)iPS細(xì)胞的過程中是必須的， Klf4和c-Myc的作用則是改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，有利于Oct4和Sox2的結(jié)合，提高誘導(dǎo)成功的效率。方法一，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，可能會因?yàn)橥庠椿虿迦爰?xì)胞基因組，干擾了內(nèi)源基因的表達(dá)，容易誘發(fā)癌癥；方法二，使用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，用一種小分子物質(zhì)代替以往使用的一種癌基因，就可以成功得到iPS細(xì)胞；方法三，無需逆轉(zhuǎn)錄病毒載體誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，因此也就避免了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所帶來的基因插入、整合、突變等問題。第三部分，國內(nèi)和國外iPS細(xì)胞的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 iPS細(xì)胞 誘導(dǎo)因子 逆轉(zhuǎn)錄病毒 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

中圖分類號：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

2006年日本科學(xué)家山中伸彌在世界著名學(xué)術(shù)雜志《細(xì)胞》上率先報(bào)道了iPS干細(xì)胞的研究。他們把Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、增殖能力、表觀遺傳修飾類，以及細(xì)胞分化等方面都表現(xiàn)出了與胚胎干細(xì)胞相似功能，他們將這類細(xì)胞命名為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞。2007年，科學(xué)家們運(yùn)用相似的方法，通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4導(dǎo)入人的成纖維細(xì)胞，成功獲得了人的iPS細(xì)胞。人iPS細(xì)胞的獲得使人們開始將視線投向iPS細(xì)胞的醫(yī)療應(yīng)用之中，運(yùn)用iPS技術(shù)獲得病人特異的iPS細(xì)胞，進(jìn)行藥物篩選或基因治療。近年來對于IPS細(xì)胞研究，取得了很大的突破，這為組織工程提供了豐富的細(xì)胞來源。

與ES細(xì)胞相比，iPS細(xì)胞的獲得方法相對簡單和穩(wěn)定，不需要使用卵細(xì)胞或者胚胎，因而具有更廣泛的應(yīng)用前景。iPS細(xì)胞的建立進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離，iPS干細(xì)胞在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價(jià)值。iPS干細(xì)胞在體外已成功地被分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心血管細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞等，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現(xiàn)。

1 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)外源基因和誘導(dǎo)方法

1.1 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)外源基因

IPS細(xì)胞的建立主要是通過病毒介導(dǎo)或者其他的方式將若干多個(gè)多能性相關(guān)的外源基因?qū)胍逊只募?xì)胞即宿主細(xì)胞中，在合適的培養(yǎng)條件下，這些已分化的細(xì)胞就會轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞。

iPS細(xì)胞誘導(dǎo)關(guān)鍵外源基因有四個(gè)，分別是： Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。

Oct4，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，是哺乳動物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子，能與含八聚體基序的DNA結(jié)合從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。它主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞中，對于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新具有極其重要的作用。Sox2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因家族的一個(gè)成員。轉(zhuǎn)錄因子是與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。癌癥基因c-Myc，是一種人類最容易過度表現(xiàn)的致癌基因，它可以抑制ES細(xì)胞的分化，對某些成體干細(xì)胞的自我更新起到一定的作用。c-Myc基因的產(chǎn)物為62KD的磷酸化蛋白P62c-mgc，是由c-Myc基因的外顯子2和3共同編碼的由439個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，定位細(xì)胞核內(nèi)，為核蛋白，依C-one編碼產(chǎn)物，功能分類，c-Myc癌基因?qū)俸说鞍谆?，具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，并具有與染色體、DNA結(jié)合的特性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。Klf4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子，是進(jìn)來我們研究較多的Klf家族的成員，它能夠通過與下游基因啟動子區(qū)的Klf4結(jié)合元件相結(jié)合，從而直接調(diào)控下由基因的轉(zhuǎn)錄，是生物體內(nèi)一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)體外細(xì)胞的增生與分化。

生化及分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Oct4和Sox2基因?qū)τ谂咛ジ杉?xì)胞多能性的維持具有非常重要的作用，在誘導(dǎo)重構(gòu)iPS細(xì)胞的過程中是必須的，正是這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子維持了人類iPS細(xì)胞的多潛能性，而Klf4和c-Myc的作用則是改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，有利于Oct4和Sox2的結(jié)合，提高誘導(dǎo)成功的效率。

有研究表明，兩個(gè)原癌基因Klf4和c-Myc可能在重編程宿主細(xì)胞增殖中起到一定的作用，加速了形成過程，提高了iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。一種推測是Klf4和c-Myc這兩個(gè)因子共同作用，使宿主細(xì)胞發(fā)生了類似于癌化的轉(zhuǎn)化。另一種猜測則認(rèn)為c-Myc基因修飾了宿主細(xì)胞的染色體狀態(tài)，活化了相關(guān)基因，從而使得重編程基因更接近于所必需的基因。第三種猜測則認(rèn)為c-Myc基因的過表達(dá)可以促進(jìn)DNA的復(fù)制，從促進(jìn)外源重編程因子調(diào)控其重建其表觀遺傳狀態(tài)，而Klf4可以刺激宿主細(xì)胞中Leftyl基因的轉(zhuǎn)錄，與Oct4和Sox2共同作用，在宿主細(xì)胞中表達(dá)胚胎干細(xì)胞的關(guān)鍵基因。因此， Oct4可能是重編程過程中唯一一個(gè)獨(dú)立作用的因子，其他的因子可能只是起到了協(xié)同的作用。

1.2 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)方法

1.2.1使用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞

將分別攜帶來Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4外源基因的4種逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染已分化的宿主細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染過程中添加維生素C等來提高iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。應(yīng)用該方法誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的特異性較高。缺點(diǎn)是，該方法可能會導(dǎo)致外源基因插入或者整合到宿主細(xì)胞基因組，從而干擾了內(nèi)源基因的表達(dá)，容易誘發(fā)癌癥。

1.2.2使用質(zhì)粒為載體誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞

使用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法成功構(gòu)建了小鼠iPS細(xì)胞。用一種小分子物質(zhì)質(zhì)粒代替以往使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，包被Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。與使用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞。相比于以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，該方法能夠避免外源基因插入細(xì)胞基因組，不容易造成外源基因插入整合的問題。但該方法要求實(shí)驗(yàn)條件較高，且轉(zhuǎn)染效率低。

1.2.3使用其他載體誘導(dǎo)產(chǎn)生無外源基因插入的iPS細(xì)胞

將iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療，存在著外源基因表達(dá)沉默以及插入引起基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。因此，獲得非外源基因插入的iPS細(xì)胞是目前研究的熱點(diǎn)。體細(xì)胞被導(dǎo)入的外源基因誘導(dǎo)重編程為iPS細(xì)胞，使其表觀遺傳發(fā)生改變。以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，外源基因容易插入或者整合到宿主細(xì)胞基因組，容易使生物體形成腫瘤。為了增加iPS細(xì)胞用于醫(yī)學(xué)治療的安全性，經(jīng)過努力將外源基因載體做出了改進(jìn)，避免使用病毒核酸序列，改用非整合基因傳遞方法。使用一些小分子或細(xì)胞可滲透蛋白作為載體誘導(dǎo)重編程。一些小分子，如丙戊酸鈉，丁酸，5-氮胞苷等，都可以促進(jìn)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)。

獲得無外源基因插入的iPS細(xì)胞主要有以下途徑：

（1）使用不會整合到宿主細(xì)胞基因組DNA的載體來誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行重編程；

（2）進(jìn)行iPS細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)，使用整合載體，在得到iPS細(xì)胞以后再將宿主細(xì)胞整合載體取出來；

（3）使用RNA和蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，取代使用核酸載體系統(tǒng)。

無外源基因整合的iPS細(xì)胞是通過采用腺病毒作為載體將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為多功能干細(xì)胞。腺病毒基因組無法在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，因此不會整合入宿主細(xì)胞基因組中。使用腺病毒載體轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因，避免了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所帶來的基因插入、整合、突變等問題。IPS細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率在非外源基因整合iPS細(xì)胞中約0.001%，而在整合外源基因的iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約0.1%-1%。這是因?yàn)?，腺病毒載體所攜帶的外源基因在細(xì)胞內(nèi)只能表達(dá)3～8天，維持時(shí)間較短，不足以完成表觀遺傳改變，所以轉(zhuǎn)染成功率低。loxP位點(diǎn)整合依賴重組質(zhì)粒遞呈載體，該載體可以通過瞬時(shí)表達(dá)Cre重組酶將整合在基因組上的外源基因去除。

2 近年iPS 細(xì)胞的研究

2.1 國內(nèi) iPS 細(xì)胞的研究進(jìn)展

2007年，裴端卿等利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體向小鼠成纖維細(xì)胞導(dǎo)入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四種基因，誘導(dǎo)得到iPS細(xì)胞。接下來，他們將小鼠腦膜細(xì)胞改造為iPS細(xì)胞。2010年，他們又發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加維生素C可以提高誘導(dǎo)iPS的形成效率。這一發(fā)現(xiàn)，極大地促進(jìn)了iPS在各個(gè)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

鄧宏魁等人于2008年研究發(fā)現(xiàn)，兩種因p53 siRNA和UTF1可以提高誘導(dǎo)iPS 細(xì)胞成功率。2011年，他們又用四個(gè)小分子組合加Oct4的方法誘導(dǎo)iPS 細(xì)胞，可以取代經(jīng)典四因子中的三個(gè)因子Sox2，Klf4和C-Myc，誘導(dǎo)獲得iPS細(xì)胞。

曾凡一研究小組在2009年共構(gòu)建了37株iPS細(xì)胞系，將篩選后的細(xì)胞系，注入多枚四倍體囊胚，用以獲得嵌合胚胎。在嵌合胚胎妊娠足月后，得到了嵌合體小鼠，并且這些嵌合體小鼠會產(chǎn)生第二和第三代后代。高紹榮研究小組在2011年利用相似的方法獲得嵌合體小鼠，并且能夠穩(wěn)定遺傳到第二代。后來，通過對第二代嵌合體小鼠采樣分離細(xì)胞后，同樣能夠獲得iPS細(xì)胞克隆集落。其小組研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Rcor2的表達(dá)可阻止胚胎干細(xì)胞的增殖，降低其多能性，影響iPS的誘導(dǎo)效率。但是，Rcor2的外源性表達(dá)則可促進(jìn)iPS誘導(dǎo)，提高誘導(dǎo)效率。

2.2國外 iPS細(xì)胞的 研究進(jìn)展

2006年，日本科學(xué)家山中伸彌首次利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入了4個(gè)與多能性有關(guān)的調(diào)控基因（Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4），最后得到了具有類似于胚胎干細(xì)胞某些特性的多能干細(xì)胞。這是世界上首次得到iPS細(xì)胞，也是首次提出這個(gè)新的概念。在后續(xù)發(fā)表的研究文獻(xiàn)報(bào)道中，Yamanaka等從4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4）中去掉了腫瘤相關(guān)因子c-Myc，也成功獲得iPS細(xì)胞。與此同時(shí)，俞君英研究小組用他們自己篩選出的4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2，Nanog和Lin28）也成功實(shí)現(xiàn)了人類皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPSCs。

2008 年，德國學(xué)者Kim JB等把Oct4，Sox2，c-Myc 和Klf4減少為2個(gè)內(nèi)生因子，通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞，成功獲得 iPS細(xì)胞。后來，Schler HR研究小組有進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目減少到只有一個(gè)，其研究小組將 Oct4 以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導(dǎo)入到小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，成功獲得iPS。

在最近的研究中，發(fā)現(xiàn)小鼠iPS細(xì)胞來源的畸胎瘤會在皮下空間引發(fā)同系小鼠的免疫排斥反應(yīng)。相反的，皮膚和骨髓組織同系移植，或者iPS來源的肝臟和神經(jīng)原細(xì)胞只表現(xiàn)除了有限的免疫反應(yīng)或者無免疫反應(yīng)。這些研究主要是針對畸胎瘤的免疫原性，組織來源的嵌合體小鼠和異位移植，但是缺少令人信服的臨床研究。iPS細(xì)胞來源的肝細(xì)胞可以對受損肝臟進(jìn)行細(xì)胞治療，這是藥物治療無法比擬的。然而如何對iPS細(xì)胞進(jìn)行精確體外分化，如何提高分化率，仍舊是困擾我們的又一項(xiàng)難題。盡管iPS細(xì)胞有著誘人的臨床應(yīng)用前景，但目前還存在著很多難關(guān)需要克服。因此，要獲得安全性高、外源基因高效表達(dá)的誘導(dǎo)iPS 細(xì)胞，如何對iPS細(xì)胞進(jìn)行體外分化，提高分化率，仍需我們繼續(xù)努力。

參考文獻(xiàn)

[1] Takahashi，K，and yamanaka，S.2006.Induction of pluri potent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126：663-676.

[2] Nakagawa，M.，Koyanagi，M.，Tanabe，K.，Takahashi，K.，Iehisaka，T.，Aoi，T.， Okita，K.，Moehiduki，Y.，Takizaw，N.，and Yamanaka，s.（2008）.Generation of induced Pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 26，101-106.

[3] Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，Weir G，Hochedlinger K.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 2008，322：945-949.

[4] Kaji，K.，Norrby，K.，Paca.A.，Mileikovsky，M.，Mohseni，P.，and Woltjen，K.（2009）.Virus-free induction of Pluri Potency and subsequent excision of reprogramming factors.Nature 458：771-775.

[5] Esteban，M.A.et al.2010.Vitamin c enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 6： 71-79.

[6] Li，Y.et al.2010.Generation of iPScs from mouse fibroblasts with a single gene，oct4，and small molecules. Cell research 21：196-204.

[7] Zhao，X.et al.2009c.IPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 461：86-90.

[8] Yang，P.et al.2011.Rcor2 is a subunit of the lsd1 complex that regulates as cell property and substitutes for sox2 in reprogramming somatic cells to pluripotency.Stem Cells doi：10.1002/stem.634.

[9] Nakagawa，M.et al.2007. Generation of induced pluripotent stem cells without myc from mouse and human fibroblasts.Nature biotechnology 26：101-106.

[10] Wernig，M.et al.2007.In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent es-cell-like state.Nature 448：318-324.

[11] Kim，J.B.et al.2008a.Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 454：646-650.

[12] Araki，R.，Uda，M.，Hoki，Y.，Sunayama，M.，Nakamura，M.，Ando，S.，Sugiura， M.，Ideno，H.，Shimada，A.，Nifuji，A.，and Abe，M.（2013）.Negligible immunogenicity of terminally differentiated cells derived from induced pluripotent or embryonic stem cells. Nature，494：100-104.