基于ITS序列和BOX－PCR鑒定廣葉繡球菌菌株*

楊 馳，林衍銓，馬 璐，江曉凌，應(yīng)正河

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014；2.特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

基于ITS序列和BOX－PCR鑒定廣葉繡球菌菌株*

楊 馳，林衍銓**，馬 璐，江曉凌，應(yīng)正河

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014；2.特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia）是一種藥食兼用的大型真菌，2010年福建省率先實現(xiàn)繡球菌工廠化栽培，并建立了國內(nèi)第一個繡球菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)基地，形成繡球菌“科研－基地－示范－銷售”的產(chǎn)業(yè)化體系。據(jù)文獻(xiàn)報道，東亞地區(qū)有3個繡球菌種，但是生產(chǎn)中所應(yīng)用的菌株，目前并不清楚其種類。利用ITS序列分析了目前廣泛使用的5個菌株 [SP－A、SP－B、SP－C（閩繡1號）、SP－D、80458]，發(fā)現(xiàn)其均屬于廣葉繡球菌，并利用BOXPCR技術(shù)分析這5個菌株的差異，發(fā)現(xiàn)菌株80458與其他4個菌株相比差異很大。

廣葉繡球菌；ITS序列；BOX－PCR

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 是一種藥食兼用的大型真菌，生長在針葉樹種的樹樁上，廣泛分布于日本、中國、美國、加拿大、法國等北溫帶國家。近年來，繡球菌方面的研究備受關(guān)注，主要是因為它味道鮮美、營養(yǎng)豐富，且具有抗腫瘤[1－3]、免疫調(diào)節(jié)[2,4,5]、抗炎癥反應(yīng)[6]、提高造血功能[7－8]等保健藥效功能。2010年，福建省率先在國內(nèi)實現(xiàn)繡球菌工廠化栽培，并建立了國內(nèi)第一個繡球菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)基地，形成繡球菌“科研－基地－示范－銷售”的產(chǎn)業(yè)化體系。目前為止，全國僅福建省能夠?qū)崿F(xiàn)繡球菌商業(yè)化栽培，并已形成一定規(guī)模，在福州、三明等地已有3個繡球菌生產(chǎn)企業(yè)，日產(chǎn)鮮菇2.5 t[9]。福建已成為全國唯一的集繡球菌研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)與出品基地。然而，目前廣葉繡球菌品種比較混亂，需要可靠的方法來進(jìn)行鑒定。有文獻(xiàn)報道利用RAPD和SRAP分子標(biāo)記對繡球菌進(jìn)行鑒定[10-11]，以及利用Internal Transcribed Spacer（ITS）序列進(jìn)行分類研究[12-13]。為了更好地保護(hù)及開發(fā)利用該資源，采用ITS序列分析法和BOX-PCR法分析了現(xiàn)有的5個菌株，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用廣葉繡球菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

廣葉繡球菌菌株SP-A、SP-B、SP-C（閩繡1號）、SP-D由福建省農(nóng)科院食用菌所保藏并提供，菌株80458購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 DNA的提取與檢測

利用新鮮的菌絲為材料，0.1 g菌絲體液氮研磨，置于 1.5 mL離心管中。采用 CTAB（Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide）法[14]提取DNA。利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.3 ITS鑒定

采用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’， ITS4:5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’） 對廣葉繡球菌進(jìn)行鑒定。ITSPCR反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus） 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1） 4 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U·μL-1） 1 μL，ITS1/ ITS4（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O補(bǔ)足到50 μL。擴(kuò)增程序為：98℃預(yù)變性7 min；98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min；72℃補(bǔ)平5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有條帶的送到鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。將測得的ITS序列利用DNAMAN 6.0進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹，以Sparassis sp.QZ-2012a voucher KFRI 923的ITS序列作為參照。

1.4 BOX-PCR分析

以 DNA為模板，引物為：BOXA1R 5’CTACGGCAAGGCGACGCTGACG 3’。擴(kuò)增體系為：5×Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1） 4 μL，BOX Primer（10 μmol·L-1） 1.0 μL，模板DNA（500 ng·μL-1） 1.0 μL，KOD plus DNA聚合酶（TOYOBO）1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。BOXPCR擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性l min，58℃退火l min，68℃延伸1 min，進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，68℃最終延伸5 min。獲得的PCR產(chǎn)物于-20℃保存。各取PCR產(chǎn)物5 μL分別與1 μL 6×DNA loading buffer混勻，用DNAMarker作參照，2%瓊脂糖凝膠電泳，并用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣葉繡球菌DNA的提取

采用CTAB法提取廣葉繡球菌菌株P(guān)-A、SP-B、SP-C（閩繡1號）、SP-D和80458的DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，具有單一的條帶，能夠用于后續(xù)的實驗分析。

圖1 廣葉繡球菌DNA的提取Fig.1 Extraction of DNA from Sparassis latifolia

2.2 ITS擴(kuò)增與序列分析

利用通用引物ITS1/ITS4、DNA為模板，擴(kuò)增廣葉繡球菌的ITS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2，擴(kuò)增結(jié)果具有單一的條帶。將PCR產(chǎn)物測序，獲得各菌株的ITS序列。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，5個菌株的ITS序列相似度達(dá)99.94%，用DNAMAN 6.0構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖3。

從圖3可以看出，發(fā)現(xiàn)菌株 SP-A、SP-B、80458、KFRI 923的ITS序列是完全一樣的，而與之相比，菌株SP-C和SP-D分別有1個堿基不同。

2.3 BOX-PCR分析

采用CTAB法提取廣葉繡球菌的DNA，以BOXA1R為引物進(jìn)行BOX-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖4 廣葉繡球菌BOX-PCR擴(kuò)增Fig.4 BOX-PCR amplification of Sparassis latifolia strains

由圖4可見，菌株SP-A、SP-B、SP-C和SP-D都有2條擴(kuò)增條帶，菌株SP-A最上面還有1條不是很明顯的擴(kuò)增條帶。與之相比，菌株80458的擴(kuò)增條帶則完全不同。說明5個菌株中，菌株80458的差異性最大。

3 討論

隨著廣葉繡球菌工廠化栽培的實現(xiàn)以及這幾年的推廣種植，廣葉繡球菌已被越來越多的人所認(rèn)識。但是由于缺乏規(guī)范的品種登記制度，出現(xiàn)了很多同名異物、同物異名的現(xiàn)象。本實驗基于ITS序列分析及BOX-PCR分析，研究了現(xiàn)有的5個菌株。結(jié)果顯示基于ITS序列分析，5個菌株的相似度高達(dá)99.94%。將栽培中最常用的菌株SP-C的ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與其相似度最高的是Sparassis sp.QZ-2012a voucher KFRI 923菌株，此菌株是廣葉繡球菌（Sparassis latifolia），說明這幾個菌株都是屬于廣葉繡球菌。這個結(jié)果跟前人報道的國內(nèi)繡球菌都是屬于廣葉繡球菌的結(jié)論是一致的[12-13]。

而BOX-PCR是根據(jù)BOX插入因子設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得微生物指紋圖譜信息的一種方法，能夠高效、方便地在種及種以下水平上揭示菌株基因組間的差異及其遺傳多樣性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，利用引物BOXA1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，菌株80458的條帶差異很大，說明菌株80458與本單位原有的4個菌株是不同的。

本實驗利用2種不同的方法，對現(xiàn)有的5個菌株進(jìn)行了分析，明確了其均屬于廣葉繡球菌，為后續(xù)研究提供分類方面的依據(jù)。

[1]趙慧慧，盧偉東，徐麗麗，等.繡球菌多糖誘導(dǎo)K562、THP-1細(xì)胞凋亡的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2013（21）：149-153.

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Identification of Sparassis latifolia Strains Based on ITS Sequences and BOX-PCR

YANG Chi,LIN Yan-quan,MA Lu,JIANG Xiao-ling,YING Zheng-he
(1.Institute of Edible Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350014,China; 2.National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding&Cultivation of Featured Edible Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350014,China)

Sparassis latifolia is an edible and medicinal fungus,which was successfully industrial cultivated in Fujian province in 2010,and the first industrial production base and industrial system were established that was consist of research,base, demonstration and sales.It was reported that there were three different varieties of Sparassis in East Asia,but it is not clear which species was the strains applied in production.The existing five strains(SP－A,SP－B,SP－C,SP－D,80458)were analyzed by ITS sequence and the results showed that they were all belong to S.latifolia.Further analysis on the difference among the five strains by BOX－PCR showed that the 80458 strain was most different compared with other four strains.

Sparassis latifolia;ITS sequence;BOX－PCR

S646.9

A

1003-8310（2016）05-0037-03

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.05.010

*項目來源：福建省公益類科研院所專項（2016R1019－4）；福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目（2014S1477－8）；福建省星火計劃項目（2015S0027）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊PI項目（2016PI－44）。

楊馳（1987－），男，碩士，實習(xí)研究員，主要從事食（藥）用菌分子生物學(xué)研究。E－mail:yc113078＠163.com

**通信作者：林衍銓（1963－），男，?？疲芯繂T，主要從事食（藥）用菌栽培研究。E－mail:lyq－406＠163.com

2016－07－16