白頭翁屬藥用植物及藥材鑒別研究＊

張立秋，于俊林，姚 輝，石林春，宋經(jīng)元＊＊

（1.通化師范學院 制藥與食品科學學院 通化 134002；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 北京 100193）

白頭翁屬藥用植物及藥材鑒別研究＊

張立秋1，于俊林1，姚 輝2，石林春2，宋經(jīng)元2＊＊

（1.通化師范學院 制藥與食品科學學院 通化 134002；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：本研究對白頭翁、朝鮮白頭翁、興安白頭翁3種藥用植物及藥材進行了形態(tài)分類和ITS2序列分子鑒別研究，為建立其分子鑒定方法提供有力依據(jù)。方法：通過對長白山區(qū)白頭翁屬3種藥用植物進行野外實地考察采樣，形態(tài)分類描述及提取樣品總DNA，擴增ITS2序列、雙向測序。所得序列經(jīng)CodonCode Aligner拼接、比對，采用MEGA 6.0軟件對樣品進行變異位點分析、計算種內(nèi)和種間遺傳距離（K2P）并構(gòu)建鄰接樹（NJ）。結(jié)果： 形態(tài)鑒別容易區(qū)分白頭翁與朝鮮白頭翁和興安白頭翁，但朝鮮白頭翁和興安白頭翁不易區(qū)分，ITS2序列片段長度均為219 bp，3種藥用植物的藥材ITS2序列與其基原植物序列一致，種間變異位點有6個，遺傳距離顯示物種種內(nèi)最大K2P距離遠遠小于種間最小K2P距離，NJ 樹結(jié)果顯示，白頭翁、朝鮮白頭翁、興安白頭翁均可明顯區(qū)分。結(jié)論：ITS2 序列能夠準確鑒定白頭翁屬3種藥用植物的藥材和基原植物，可作為形態(tài)鑒別的有力補充。

白頭翁屬 形態(tài)鑒別 分子鑒定 DNA條形碼 ITS2

白頭翁屬（Pulsatilla Adans）為毛茛科（Ranunculaceae）多年生草本植物，有根狀莖，常有長柔毛。全世界約有43種，中國有11種，主產(chǎn)北溫帶[1]，其中東北分布有白頭翁P. chinensis（Bunge）Regel、朝鮮白頭翁P. cernua（Thunb.）Bercht.et Opiz、興安白頭翁P. dahurica（Fisch.）Spreng。白頭翁屬植物中大多數(shù)含有兩種類型五環(huán)二萜皂苷化合物，即羽扇豆烷型和齊墩果烷型[2-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白頭翁屬植物具有抗腫瘤[7-9]、抗炎，抗氧化、抗菌，增強免疫等功效[10，11]，近年研究還發(fā)現(xiàn)朝鮮白頭翁所含的某些活性成分對治療阿爾茨海默病效果顯著[2，4]?！吨兴幋筠o典》中記載，該屬多種植物被當作《中國藥典》收載的同屬植物白頭翁入藥[12]，目前國內(nèi)白頭翁藥材主要靠采挖野生植株獲得，白頭翁藥材形態(tài)及活性成分相似，難以用形態(tài)及理化等方法有效鑒別[13]。另外朝鮮白頭翁和興安白頭翁在植株形態(tài)上極其相似，不易鑒別區(qū)分。

DNA 條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）是利用一段標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA 片段自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)， 它可以對物種進行快速準確鑒定[14]。目前DNA 條形碼研究技術(shù)已逐步走向成熟[15]，對于分類學中難以區(qū)分的類群，采用 DNA 條形碼可以拋開形態(tài)上的假象，從基因水平上提供一種分類依據(jù)[16]。本研究通過對白頭翁屬物種進行野外形態(tài)觀察描述，并采用DNA條形碼ITS2序列，對來自吉林和遼寧省內(nèi)的樣品進行研究和探討，為白頭翁屬藥用植物的藥材來源及基原物種的確定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文共收集58份樣品，包括白頭翁、朝鮮白頭翁、興安白頭翁3個物種，分別來自遼寧省，吉林省的長春市、通化地區(qū)各縣。樣品經(jīng)通化師范學院于俊林教授鑒定，保存在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，詳細信息見表1。

1.2 方法

取硅膠干燥葉片約20 mg， 用DNA提取研磨儀研磨2 min（30次/s）后， 用植物 DNA提取試劑盒提取總DNA；藥材提取參考羅焜等[17]研究方法，ITS2序列引物、PCR反應(yīng)條件、序列拼接及比對參照Chen 等[18，19]研究。應(yīng)用MEGA 6.0進行種內(nèi)和種間遺傳距離計算[20]，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。

表1 試驗樣品信息表

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

2.1.1 白頭翁

多年生草本，高50 cm左右，全株密被白柔毛。根圓錐形?；~三出，3全裂，中央裂片通常具柄，3深裂，側(cè) 生裂片較小，不等3裂；葉柄長5-7 cm。花果期4-6月。分布中國大部分地區(qū)，生于草地、山坡、林緣、河岸及灌叢。詳見圖1。

2.1.2 朝鮮白頭翁

植株高10-40 cm，全株被開展的白毛。根狀莖發(fā)達，長達3-8 cm，粗約0.5 cm，基生葉多數(shù)，葉柄長5-15 cm。葉片羽狀全裂，各裂片又2-3深裂，花果期4-6月。分布于遼寧南部，吉林東部。生于草地、山坡、林緣、河岸及灌叢。詳見圖1。

2.1.3 興安白頭翁P

多年生草本，植株高25-40 cm。根狀莖長16 cm，粗5-7 mm?；~7-9；葉片三全裂或近羽狀分裂，一回中全裂片有細長柄，又三全裂，二回裂片深裂；花果期4-6月。分布中國吉林東部、黑龍江。生于山坡草地、林緣、灌叢。詳見圖1。

圖1 白頭翁、朝鮮白頭翁與興安白頭翁植株形態(tài)特征

2.2 形態(tài)鑒別

通過野外跟蹤考察，白頭翁與朝鮮白頭翁及興安白頭翁植株形態(tài)上區(qū)別顯著：白頭翁基生葉三出，朝鮮白頭翁和興安白頭翁葉片羽狀分裂；朝鮮白頭翁和興安白頭翁區(qū)別為：朝鮮白頭翁葉緣有毛，興安白頭翁葉緣無毛，但不易觀察鑒別，興安白頭翁花期較朝鮮白頭翁花期晚，花期過后，也不易鑒別。藥材形態(tài)十分相似，不易區(qū)分。

2.3 分子鑒定

2.3.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序結(jié)果

從全部樣品的葉和根提取基因組總DNA，對DNA進行PCR擴增，擴增后PCR產(chǎn)物電泳均顯示較亮條帶，表明基因組總DNA提取質(zhì)量較好。對PCR產(chǎn)物進行雙向測序，得到高質(zhì)量的ITS2條形碼序列。

2.3.2 3種藥用植物的ITS2序列特征及其變異位點分析

白頭翁屬植物白頭翁、興安白頭翁和朝鮮白頭翁ITS2片段長度均為219 bp，所有基原植物樣品葉片獲得的ITS2條形碼序列的單倍型與從該植物藥材根獲得的單倍型一致，沒有發(fā)現(xiàn)新的單倍型。結(jié)果表明白頭翁、興安白頭翁和朝鮮白頭翁間ITS2序列含6個變異位點，38位點處朝鮮白頭翁和白頭翁都為G，興安白頭翁為A；201位點處朝鮮白頭翁和興安白頭翁都為T，白頭翁為A，因此在38位點和201位點為G和T的為朝鮮白頭翁，G和A的則為白頭翁，A和T的則為興安白頭翁。由此利用這兩個位點可以將白頭翁、朝鮮白頭翁與興安白頭翁藥材及基原植物很好區(qū)分開，結(jié)果見表2。

2.3.3 物種ITS2序列的K2P遺傳距離分析及NJ樹構(gòu)建

白頭翁屬3個物種種內(nèi)和種間遺傳距離見表3，結(jié)果表明白頭翁種內(nèi)的遺傳距離是0-0.004 6，與朝鮮白頭翁、興安白頭翁種間遺傳距離均為0.013 9-0.018 6，種間最小K2P距離大于種內(nèi)最大K2P距離。朝鮮白頭翁、興安白頭翁的種內(nèi)遺傳距離均為0，種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)。

基于ITS2序列，采用了NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明興安白頭翁、朝鮮白頭翁、白頭翁各自聚為一支，呈現(xiàn)明顯的單系性。所以采用K2P遺傳距離、NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹均可區(qū)分白頭翁屬3個物種的藥材及基原植物。

表2 白頭翁、朝鮮白頭翁與興安白頭翁ITS2序列變異位點分析

表3 白頭翁、朝鮮白頭翁與興安白頭翁ITS2序列的K2P遺傳距離

4 討論

通過野外考察，對白頭翁屬3種藥用植物進行形態(tài)描述，其中白頭翁與朝鮮白頭翁和興安白頭翁較易區(qū)分，朝鮮白頭翁和興安白頭翁不易鑒別。王勝勇等[21]對白頭翁同名異物類藥材進行了顯微鑒定，結(jié)果表明白頭翁屬植物的韌皮纖維、木質(zhì)部、髓部和中心部裂隙的顯微特征可用于鑒別白頭翁屬植物。李海燕等[22]對白頭翁屬藥用植物的HPLC指紋特征研究表明，可以區(qū)分白頭翁和朝鮮白頭翁，但無法區(qū)分細葉白頭翁和興安白頭翁。本屬的這3個種在形態(tài)指標中除葉裂片數(shù)、裂片形態(tài)等少數(shù)指標有分類意義外，大部分指標差異區(qū)分不顯著，因此尋找穩(wěn)定的分類指標及考察影響指標變異的因素是深入研究的方向。

辛天怡等研究表明ITS/ITS2對羌活藥材及基原植物均可進行鑒別[23]。張午曲等[24]報道對4種白頭翁屬藥用植物的ITS序列進行研究，將白頭翁和興安白頭翁歸為一組，朝鮮白頭翁和細葉白頭翁歸為一組，該研究只收集4個樣本進行DNA提取分析，試驗的樣本數(shù)少，不能反映種內(nèi)的變異情況。本研究通過分析比較白頭翁屬3個種ITS2序列的變異位點、種內(nèi)和種間K2P距離及NJ樹，結(jié)果表明ITS2序列可以準確鑒別白頭翁和興安白頭翁及朝鮮白頭翁的藥材及基原植物。與其它的傳統(tǒng)方法相比，DNA條形碼技術(shù)具有材料用量少、鑒定準確的優(yōu)點；對形態(tài)上鑒定較難的朝鮮白頭翁和興安白頭翁，有著很大優(yōu)勢。

《中國藥典》收載的正品藥材來源為白頭翁，朝鮮白頭翁和興安白頭翁作為地方習用藥材也被使用入藥，而明確藥材品種來源對保證用藥安全具有重要意義，但非專業(yè)的藥材鑒別人員很難準確區(qū)分各品種的藥材，而DNA條形碼鑒定不受藥材性狀的影響，即使沒有任何鑒別經(jīng)驗的人員通過DNA條形碼標準化操作流程可快速、準確完成對白頭翁屬3種藥用植物及其藥材的鑒別。后續(xù)還應(yīng)進一步加大白頭翁屬基原植物和藥材的樣本量，為開展白頭翁屬藥用植物的形態(tài)和分子鑒定分類系統(tǒng)研究奠定基礎(chǔ)。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建白頭翁、朝鮮白頭翁與興安白頭翁的NJ樹

1 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志.北京:科學出版社, 1980∶ 62．

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Identification of Plants and Medicinal Materials in Pulsatilla Mill.

Zhang Liqiu1, Yu Junlin1, Yao Hui2, Shi Linchun2, Song Jingyuan2
(1. College of Pharmaceutical and Food Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was designed to identify Pulsatilla chinensis, P. cernua and P. dahurica, and carry out their morphological classification and molecular identification. After field investigation and sampling the three medicinal plant species in Changbai Mountain area, morphological characters of the three species were described. The ITS2 sequences were amplified and sequenced bi-directionally. Then the sequences were assembled and compared by CodonCode Aligner. The genetic distances were computed in accordance with the kimura 2-parameter (K2P), while the NJ tree was built by using MEGA 6.0. Based on morphological characters, P. chinensis can be easily distinguished from P. cernua and P. dahurica, while P. cernua was difficult distinguished from P. dahurica. It was also found that the ITS2 sequences of three medicinal plant species had 219 bp in length, while the medicinal materials and the original plants shared the same ITS2 sequence. There were 6 variations of ITS2 sequences in the three medicinal plant species. The maximum intra-specific genetic distances were lower than the minimum inter-specific genetic distances. The NJ tree exhibited that the three species could be distinguished. All the results demonstrated that the ITS2 sequences could identify the three original plants and medicinal materials of Pulsatilla Mill. accurately, which brought out a useful tool for species identification.

Pulsatilla Mill., morphological identification, molecular identification, DNA barcoding, ITS2

10.11842/wst.2016.02.004< class="emphasis_bold">中圖分類號：R

R282.5

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-30

修回日期：2015-12-01

＊ 科學技術(shù)部國家科技基礎(chǔ)性工作專項項目子項目（2014FY130400）:長白山區(qū)藥用植物資源考察與DNA條形碼數(shù)據(jù)采集，負責人：于俊林。

＊＊ 通訊作者：宋經(jīng)元，本刊編委，研究員，博士生導師，主要研究方向：中藥資源學、DNA條形碼。