兩種石油烴降解菌的鑒定及其對石油烴底物的降解*

劉 虹 楊元元 劉 娜# 宋清泉 溫 鋼 付 凈 翦英紅(.吉林化工學(xué)院資源與環(huán)境工程學(xué)院，吉林 吉林 0；.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，吉林 長春 00；.吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 0)

人類在石油生產(chǎn)、貯運(yùn)、煉制加工及使用過程中，不可避免地造成石油烴的溢出和排放，使得土壤及水體環(huán)境受到石油烴污染[1-2]。石油烴污染的環(huán)境修復(fù)越來越成為人們關(guān)注的問題。其中，物理、化學(xué)方法修復(fù)石油烴污染雖然可以得到較好的效果，但因造價高、二次污染等問題使其應(yīng)用受到限制[3]。石油中含有的絕大部分烴類均可被微生物代謝降解，因此石油烴的微生物降解成為石油烴污染修復(fù)的主要手段之一[4-5]。

石油烴是一種復(fù)雜的混合物，含有多種烴類，主要有烷烴類(正烷烴、支鏈烷烴)、芳香烴、脂環(huán)烴等[6]。在實(shí)際石油烴污染環(huán)境的微生物修復(fù)中，不同種屬的微生物對石油烴的降解能力不同，且降解的石油烴成分也不盡相同。目前已報道的烷烴降解細(xì)菌主要有假單胞菌[7-8]、不動桿菌[9]、諾卡氏菌[10]、紅球菌[11]等，而關(guān)于木糖氧化無色桿菌降解石油在國內(nèi)鮮有報道[12]，且木糖氧化無色桿菌與其他石油降解菌的混合菌協(xié)同降解石油烴方面的報道也未多見。本研究對石油污染場地篩選出的兩種單菌進(jìn)行16S rDNA堿基序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分類鑒定，并研究了銅綠假單胞菌和木糖氧化無色桿菌及其混合菌對石油烴底物的降解，為石油烴污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器設(shè)備

氣/質(zhì)聯(lián)機(jī)2014型(日本島津)、HYG-A全溫振蕩器、手提式壓力蒸汽滅菌器、LD4-2A型醫(yī)用離心機(jī)、SP-DJ系列垂直凈化工作臺、LRH-25A型生化培養(yǎng)箱、pH計(jì)、PTC-200型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

對松原油田石油污染土壤(表層0～30 cm)進(jìn)行采樣，然后以石油烴為唯一碳源，經(jīng)富集篩選、分離培養(yǎng)后所得實(shí)驗(yàn)菌株，分別命名為A6菌和A10菌。

1.3 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 000 mg/L，K2HPO41 550 mg/L，NaH2PO4850 mg/L，MgCl2·6H2O 100 mg/L，乙二胺四乙酸(EDTA) 10 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 2.0 mg/L，MnCl2·2H2O 1.0 mg/L，CaCl2·2H2O 1.0 mg/L，CoCl2·6H2O 0.4 mg/L，NaMoO4·2H2O 0.2 mg/L，CuSO4·5H2O 0.2 mg/L。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.4 石油烴測定分析方法

參考美國環(huán)境保護(hù)署8270C方法，采用液-液萃取—?dú)庀嗌V/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)進(jìn)行石油烴濃度定性、定量分析。GC條件：汽化室溫度為280 ℃；色譜柱為RTX-5MS石英毛細(xì)柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。升溫程序：50 ℃保持3 min，以3 ℃/min速率升至100 ℃，以5 ℃/min速率升至200 ℃，以8 ℃/min速率升至290 ℃，保持10 min。載氣為氦氣(純度為99.999%)，流量為2.0 mL/min，壓力為31.2 kPa，隔膜吹掃3.0 mL/min。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量為70 eV；傳輸線溫度為230 ℃；離子源溫度為200 ℃；檢測電壓為0.85 kV；掃描范圍(質(zhì)核比)為30～500；燈絲開啟2.5 min；記錄范圍為30～60 min。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 生理生化特性測定及DNA提取方法

生理生化特性測定方法參考文獻(xiàn)[13]，DNA提取方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.5.2 16S rDNA引物、PCR擴(kuò)增及序列測定

16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增引物：上游引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。取5 μL反應(yīng)液與1 μL緩沖液混合，在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠中150 V電壓下電泳檢測。

引物合成及PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.5.3 石油烴的降解

于19個錐形瓶中分別加入50 mL的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基、200 mg 0#柴油。其中1個樣品不加菌做空白對照，其余18個樣品每6個加入10 mL同種石油烴降解菌(A6菌、A10菌、混合菌(A6菌和A10菌質(zhì)量比為1∶1))培養(yǎng)液(吸光度(OD600)約為0.6)，于120 r/min、30 ℃下振蕩培養(yǎng)6 d。每隔1天取3個加入菌株后的樣品，分別加入10 mL正己烷進(jìn)行萃取。萃取后的有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，用GC測定石油烴殘留量，計(jì)算石油烴降解率。

其中，兩種單菌及其混合菌對石油烴降解第6天的樣品經(jīng)取樣、萃取及無水硫酸鈉干燥后，進(jìn)行GC/MS全掃描，與空白樣品進(jìn)行對照，并利用標(biāo)準(zhǔn)譜圖和工作站中overlay chromatograms功能對兩種單菌及其混合菌降解污染物進(jìn)行識別。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生理生化特性

對A6菌、A10菌進(jìn)行13項(xiàng)生理生化特性測試，結(jié)果見表1。

2.2 菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育及鑒定

菌株16S rDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到長度為1 500 bp左右的基因片段，測序后將菌株16S rDNA序列輸入GenBank，以Blast軟件進(jìn)行序列同源性比較，選擇同源性大于98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0軟件對A6菌和A10菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，500次重復(fù)檢測，計(jì)算自引導(dǎo)值以估計(jì)系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度，其結(jié)果如圖1、圖2所示。

由圖1、圖2可知，A6菌與銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，SNP0614)進(jìn)化距離較近，A10菌與木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans，A22)進(jìn)化距離較近，并結(jié)合生理生化特性，判定A6菌在分類學(xué)屬性為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，A10菌在分類學(xué)屬性為無色桿菌屬(Achromobactersp.)。

表1 菌株生理生化特性測試結(jié)果1)Table 1 Physiological and biochemical characteristics of bacteria

注：1)“+”表示陽性，“-”表示陰性。

注：該比例尺為核苷酸替代率，如0.100 0就表示100個核苷酸中有10個是不同的，用來表示兩個菌種的遺傳距離。圖2同。圖1 A6菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA series of A6

圖2 A10菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA series of A10

Pseudomonasaeruginosa可產(chǎn)生鼠李糖脂、吩嗪類色素綠膿菌素及各種蛋白酶等胞外活性物質(zhì)。其中，產(chǎn)生的鼠李糖脂能加快疏水性有機(jī)物的傳質(zhì)速度，促進(jìn)菌株對分子量較大的C26～C33正構(gòu)烷的降解；吩嗪類色素綠膿菌素也可促進(jìn)菌株對烴類的降解。在石油烴污染環(huán)境修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用價值[15]。Achromobacterxylosoxidans是一種高效廣譜降解石油烴并產(chǎn)生生物表面活性的菌株。目前，關(guān)于Achromobacterxylosoxidans降解石油烴在國內(nèi)鮮有報道，因而，本研究鑒定并分析其降解石油烴效果拓寬了降解石油烴菌株的種類。

2.3 兩種單菌及其混合菌對石油烴的降解效果

石油烴初始質(zhì)量濃度為4 000 mg/L時，兩種單菌及其混合菌對石油烴的降解率曲線如圖3所示。

由圖3可見，兩種單菌及其混合菌對石油烴的降解率在初始的2 d增加較快，3 d后降解較為緩慢。這與菌株的生長相關(guān)，菌株在剛開始降解的2 d左右處于對數(shù)生長期，菌株生長較快，酶活性也較高，菌株以石油烴為唯一碳源，因此對石油烴的降解率高；3 d后，菌株生長較為緩慢，因而，降解能力逐漸降低；6 d時，兩種單菌及其混合菌對石油烴的降解率分別達(dá)到90.48%、84.34%和96.90%。說明兩種單菌及其混合菌對石油烴污染環(huán)境具有很強(qiáng)的生物修復(fù)潛力。混合菌對石油烴的降解率高于單菌，表明A6菌和A10菌可以在一定程度上互相促進(jìn)，對石油烴具有協(xié)同降解能力。推測原因是菌株之間能互相利用各自合成的酶類和代謝產(chǎn)物，促進(jìn)彼此生長，在整體上提高對石油烴的降解能力。

圖3 兩種單菌及其混合菌對石油烴的降解率曲線Fig.3 Petroleum hydrocarbon degradation rate curve of two single strains and mixed strain

由于石油烴是一種復(fù)雜的混合物，含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴等)。一種微生物通常只對特定的石油成分具有較強(qiáng)降解能力[16]，往往需通過接種混合的微生物群落，以提高微生物的降解效果。因此，混合菌對石油烴的協(xié)同降解對采用微生物群落修復(fù)環(huán)境中石油烴提供了理論支持。

2.4 兩種單菌及其混合菌對石油烴底物的降解

將空白組和各單菌及其混合菌降解石油烴6 d后的樣品進(jìn)行GC/MS全掃描后，利用標(biāo)準(zhǔn)譜圖和工作站中overlay chromatograms功能對兩種單菌及其混合菌降解污染物進(jìn)行識別，所得空白對照和A6菌、A10菌及其混合菌降解后的石油烴樣品全掃描定性對比結(jié)果如圖4至圖7和表2所示。

由圖4至圖7和表2的對比結(jié)果可知，A6菌和A10菌對石油烴底物降解的組分大致相同，兩者均能完全降解大部分直鏈烷烴、環(huán)烷烴和支鏈烷烴，部分降解C9～C27正構(gòu)烷烴，對難生物利用的姥鮫烷和植烷等也有一定程度的降解。說明兩種單菌均具有較寬的烷烴降解譜。從降解程度來看，A6菌優(yōu)于A10菌；混合菌在降解石油烴底物時，具有協(xié)同降解作用，因此混合菌對石油烴底物降解程度均優(yōu)于兩種單菌?；旌暇四芡耆到獯蟛糠种辨溚闊N、環(huán)烷烴和支鏈烷烴外，還對單菌不能徹底降解的支鏈烷烴(3,8-二甲基癸烷和2-甲基-十二烷)完全降解。上述單菌、混合菌對石油烴及底物的降解能力，為其在石油烴污染環(huán)境的生物修復(fù)提供了新的參考。

圖4 石油烴色譜圖(空白對照)Fig.4 Chromatograph chart of petroleum (blank control)

圖5 A6菌降解石油烴色譜圖Fig.5 Chromatograph chart of petroleum degraded by A6

圖6 A10菌降解石油烴色譜圖Fig.6 Chromatograph chart of petroleum degraded by A10

圖7 混合菌降解石油烴色譜圖Fig.7 Chromatograph chart of petroleum degraded by mixed strain

表2 兩種單菌及其混合菌降解石油烴全掃描定性對比結(jié)果Table 2 The two single strains,mixed strain degradation of petroleum hydrocarbons scanning qualitative comparison results

3 結(jié) 論

(1) 采用16S rDNA技術(shù)對石油污染場地篩選出的兩種單菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)生理生化特性及16S rDNA鑒定兩種單菌在分類學(xué)上分別屬于Pseudomonassp.和Achromobactersp.。

(2) A6菌和A10菌及其混合菌對石油烴的降解率(6 d)分別達(dá)到90.48%、84.34%和96.90%，其降解效果為混合菌>A6菌>A10菌。說明Pseudomonassp.和Achromobactersp.對石油烴具有協(xié)同降解能力，同時，也顯示了兩種單菌及其混合菌對石油烴污染環(huán)境具有很強(qiáng)的生物修復(fù)潛力。

(3) A6菌和A10菌均能完全降解大部分直鏈烷烴、環(huán)烷烴和支鏈烷烴，部分降解C9～C27正構(gòu)烷烴，對難生物利用的姥鮫烷和植烷等也有一定程度的降解。兩種單菌的混合菌在降解石油烴底物時，具有協(xié)同降解作用，混合菌還對單菌不能徹底降解的支鏈烷烴(3,8-二甲基癸烷和2-甲基-十二烷)完全降解。

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