石油污染微生物修復(fù)的生物安全性評價

王瑞儉 孫鵬 王金玲（北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013）

石油污染微生物修復(fù)的生物安全性評價

王瑞儉 孫鵬 王金玲（北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013）

微生物修復(fù)是當前石油污染治理的研究熱點，在實際應(yīng)用中微生物及其石油降解產(chǎn)物可能對生態(tài)環(huán)境造成破壞，對其安全性的研究應(yīng)引起重視。本文就石油污染微生物修復(fù)過程中可能造成二次污染的因素進行分析，通過策略追尋，對微生物降解石油產(chǎn)物的生物安全性研究內(nèi)容及方法進行探討，為微生物修復(fù)的生物安全性評估體系的建立提供參考。

石油污染；微生物修復(fù)；生物安全性；評價

0 引言

在人類發(fā)展，生產(chǎn)力進步過程中，石油在當代社會發(fā)展中占據(jù)重要位置。在石油開采、儲藏、輸送、提煉、銷售、使用等環(huán)節(jié)都可能發(fā)生泄漏事件，而隨之而來的污染越來越受到公眾關(guān)注。石油污染導(dǎo)致土壤、水體等理化結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起污染地生態(tài)環(huán)境的改變，直接或間接地對環(huán)境和人類生存造成危害。

1 石油污染的微生物修復(fù)技術(shù)

石油污染治理早期采用物理方法、化學(xué)方法等，因費用高、處理量小、二次污染、可行性等問題目前已經(jīng)少有應(yīng)用［1］。

微生物修復(fù)技術(shù)是應(yīng)用微生物，在適宜的營養(yǎng)及環(huán)境條件下，加快石油污染物降解速度，達到清除土壤中石油污染物的目的。該技術(shù)所需處理費用低、效果好、一般不會產(chǎn)物二次污染，被認為是當前污染治理領(lǐng)域最有價值的處理技術(shù)。目前發(fā)現(xiàn)100個屬200種微生物可降解石油組分［2，3］。

當前微生物修復(fù)研究主要集中在高效降解石油菌株的篩選、降解機制研究、微生物修復(fù)實踐［4-6］［7］等方面。

2 石油污染的微生物修復(fù)存在問題

應(yīng)用微生物修復(fù)技術(shù)治理石油污染面臨著諸多問題。如仍然缺乏降解效果好、適應(yīng)性強的石油降解菌株；降解石油的機制尚未完全清楚；安全性評價機制尚未建立等。

當前用于石油污染治理的微生物大多是土著微生物。這些微生物多為條件致病菌，經(jīng)過培養(yǎng)后再次投放于環(huán)境中，一般不會對環(huán)境造成嚴重損害。但這些微生物的存在可能影響污染地的微生物群落結(jié)構(gòu)，影響微生物生態(tài)環(huán)境。另外，投放的微生物降解石油過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也會流入環(huán)境中，這些物質(zhì)將影響周圍環(huán)境的物理性質(zhì)、化學(xué)組成等，進而改變當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境。當前關(guān)于外源微生物降解石油產(chǎn)物對污染區(qū)的植物及微生物的生物安全性方面的研究還是空白，也沒有建立起有效的安全性評價機制。

3 提高石油污染微生物修復(fù)安全性的策略

微生物修復(fù)的最終目的是將石油中有害成份吸收、利用或者轉(zhuǎn)化為低毒、無毒甚至有益的物質(zhì)。保障微生物修復(fù)過程的安全性需要考慮到以下方面。

（1）盡量選擇土著微生物進行生物修復(fù) 土著微生物對環(huán)境適應(yīng)性強，安全性好，可以最大限度地降低投放微生物對生態(tài)環(huán)境的破壞作用。在微生物篩選過程中，可以結(jié)合人工誘變技術(shù)，通過使用含高濃度石油為培養(yǎng)基等壓力脅迫的方式，誘導(dǎo)土著微生物發(fā)生基因突變，再經(jīng)正向篩選獲得石油降解能力更強的突變菌株，以達到快速修復(fù)的目的。

（2）對石油降解微生物的生長特性進行研究 分析微生物對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的需求，以保證在投放初期微生物能保持較高的石油降解及生存、繁殖能力，必要時可通過人工馴化等方式提高對投放環(huán)境的適應(yīng)性。另外，在降解后期，投放的微生物數(shù)量應(yīng)能迅速降低，以防止對自然的微生物種群結(jié)構(gòu)造成嚴重破壞，提高投放微生物對環(huán)境的安全性。這一策略在實際中是可能實現(xiàn)的，例如，本課題組篩選出的可高效降解石油的不動桿菌［8］，該菌株在以原油為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代約15次（2天/次）后，其繁殖幾乎完全停滯（未發(fā)表數(shù)據(jù)），將其投放于石油污染環(huán)境中，當繁殖停滯時，衰老細菌將大量死亡，新細菌不能產(chǎn)生而導(dǎo)致菌群數(shù)量迅速降低。

4 石油污染微生物修復(fù)的生物安全性評價

用于污染治理的微生物對生態(tài)環(huán)境必須是安全的，因此生物安全性評價是微生物應(yīng)用于石油污染治理實踐的先決條件。石油污染土壤直接影響植物及微生物，因此其微生物修復(fù)的生物安全性應(yīng)從植物和微生物兩個方面進行。

4.1 對植物生物安全性評價方法

（1）微生物直接投放法：向石油污染地的土壤中投放馴化的微生物，降解土壤中石油組分，對比分析降解前后植物生長態(tài)勢參數(shù)（發(fā)芽率、株高、鮮重、干重、根際重量、根際狀況、葉綠素含量、光合速率等），對其安全性進行評價［9，10］。這是一種直觀有效的方法。

（2）微生物降解產(chǎn)物投放法：在實驗室中完成微生物對石油的降解過程并制備降解產(chǎn)物，再按一定比例加入土壤中，栽種植物后測定植物生長態(tài)勢，對其生物安全性進行評價。受試植物應(yīng)當對石油有較強的耐受性，能適應(yīng)石油污染地的環(huán)境，易于檢測各項生理指標，且盡量選用一年生草本植物。與微生物投放法相比，石油降解產(chǎn)物的試驗條件更易于控制，操作性強，誤差小，結(jié)果重現(xiàn)性好，是前期安全性評價的理想方法。

4.2 對微生物的安全性評價方法

（1）微生物直接投放法。方法與植物相似，檢測降解前后石油污染土壤中微生物種群數(shù)量及結(jié)構(gòu)，與正常土壤對比，可獲得生物安全性信息。微生物種群結(jié)構(gòu)分析可采用以下方案：①高通量測序法。對微生物宏基因組進行分析，獲得修復(fù)前后微生物種群結(jié)構(gòu)及相對數(shù)量。這是最理想的方案，但操作復(fù)雜、技術(shù)要求高、分析成本高，不易普及；②定量PCR法。首先選擇部分有代表性菌株，設(shè)計并合成相應(yīng)定量PCR引物，然后提取土壤總DNA，應(yīng)用定量PCR的方法檢測標志性菌株的相對數(shù)量變化。該方法專業(yè)性強、誤差較大，且對提取的DNA質(zhì)量有較高要求；③脂肪酸分析法。這是一種經(jīng)典的基于GC-MS技術(shù)的微生物種群結(jié)構(gòu)分析方法，要求有相應(yīng)的大型分析GC-MS儀器；④梯度稀釋-平板計數(shù)法。這也是一種常用的微生物數(shù)量分析方法，缺點是只能對土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)進行測定，難以對微生物種群進行劃分。

（2）微生物降解產(chǎn)物投放法?？梢圆捎梦⑸锓N群結(jié)構(gòu)分析（方法同上），也可以應(yīng)用發(fā)光桿菌對其生物毒性直接進行分析。后者是將石油降解產(chǎn)物加入發(fā)光桿菌培養(yǎng)液中，毒性物質(zhì)的存在將導(dǎo)致發(fā)光桿菌的發(fā)光效率降低，通過測定一定時間內(nèi)發(fā)光強度變化即可對待測物質(zhì)的生物毒性進行分析。該方法是一種直觀、可靠的生物毒性檢測技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛用于多種毒性物質(zhì)的生物安全性分析［11，12］。

5 結(jié)語

石油污染治理是一個長期的全球性的難題。盡管微生物修復(fù)技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，但應(yīng)用于污染治理實踐還有很長的路要走。在當前建設(shè)生態(tài)文明的大前提下，對該技術(shù)的生物安全性評價成為關(guān)鍵問題之一。本文分析了微生物修復(fù)石油污染實踐中可能遇到問題，并對石油微生物修復(fù)生物安全性評價的思路與方案進行了深入探討，以期對石油污染微生物治理的實踐提供參考。

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王瑞儉（1970- ），男，漢族，山東運城人，副教授，博士，北華大學(xué)林學(xué)院，研究方向：環(huán)境科學(xué)。

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130206013SF）.