三維打印技術(shù)在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展

曾玉婷 洪雅真 王士斌

361021廈門，華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系

·綜述·

三維打印技術(shù)在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展

曾玉婷 洪雅真 王士斌

361021廈門，華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系

綜述了三維（3D）打印技術(shù)的出現(xiàn)、分類與優(yōu)勢等。介紹了該技術(shù)在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用，包括光固化立體印刷、熔融沉積成型、選擇性激光燒結(jié)和3D噴印的工作原理、存在的優(yōu)缺點以及國內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域的研究進展。目前骨組織工程支架的制備大多應(yīng)用了3D打印技術(shù)，以生物可降解的活性材料為原料制備而成。在我國該領(lǐng)域雖然發(fā)展迅速，利用3D打印技術(shù)進行人工骨合成、骨科術(shù)前模擬等已經(jīng)越來越普遍，亦取得了令人滿意的效果，但要研發(fā)出合適的生物材料以及設(shè)備精度的改進仍是亟待解決的問題。目前，仿生器官的功能化已成為3D打印技術(shù)領(lǐng)域的一大困難，其中多細(xì)胞共培養(yǎng)、血管化及支架的制備是實現(xiàn)功能化必須克服的問題，相信通過努力，該項技術(shù)將會為器官的再生與修復(fù)帶來更多令人矚目的成果。

三維打??；骨組織工程；生物材料；支架

Fund program:National Natural Science Foundation of China(31570974);Graduate Research and Inovation Program of Huaqiao University

0 引言

實體自由成型制造（solid free-form fabrication，SFF），又稱三維（three dimension，3D）快速成型技術(shù)（rapid prototyping，RP）或增材制造技術(shù)（additive manufacturing，AM），出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末，是一類較為新型的實體堆積制造技術(shù)[1-2]。其通過計算機控制，根據(jù)物體的計算機輔助設(shè)計（computer-aided design，CAD）模型或計算機斷層掃描（computed tomography，CT）等數(shù)據(jù)，定點精確堆積3D打印的材料來制造任意形狀的三維物體[3-4]。

近年來，隨著計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，3D打印技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域也隨之拓寬，尤其是在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用，如骨科模型的制造或人工骨的植入、口腔頜面外科疾病中需要植入假體來代替損壞組織以及牙齒的制造替換等。過去骨科方面的治療通常采用批量固定生產(chǎn)的方式制造臨床上所需的替代材料，由于不具有個性化的特點，往往難以與患者的病損部位很好地匹配，手術(shù)的成功率和患者的術(shù)后滿意度不高[2，5]。而利用3D打印技術(shù)則可以根據(jù)患者的具體情況，結(jié)合CT、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等技術(shù)，快速地、個性化地制造組織工程支架材料[6]。該技術(shù)不僅能實現(xiàn)植入材料和缺損部位之間的匹配，而且能同時在宏觀、微觀上調(diào)控材料的結(jié)構(gòu)，從而根據(jù)需要調(diào)整材料的修復(fù)愈合能力，達(dá)到滿意的修復(fù)效果[7-8]。

13 D打印技術(shù)的分類及其在骨組織工程中的應(yīng)用

目前在骨組織工程中應(yīng)用較多的3D打印技術(shù)主要包括光固化立體印刷（stereolithography，SLA）、熔融沉積成型（fused deposition modeling，F(xiàn)DM）、選擇性激光燒結(jié)（selective laser sintering，SLS）和三維噴?。╰hree-dimensional printing，3DP）等[5，9]。

1.1 光固化立體印刷

該技術(shù)以液態(tài)光敏樹脂為原料制作模型，在計算機的控制下根據(jù)零件的截面形狀逐點掃描，在紫外光照射下使液態(tài)樹脂層產(chǎn)生光聚合或光交聯(lián)而固化，當(dāng)?shù)谝粚硬牧瞎袒瓿珊螅豘軸方向移動平臺，在固化的材料上方覆蓋一層新的樹脂，隨后繼續(xù)逐層掃描固化，層層堆積直至成形[10-11]。近年來，由于SLA技術(shù)在手術(shù)及外科模擬方面的廣泛使用，使得該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到快速發(fā)展，特別是在牙科及骨科方面。Scalera等[12]通過調(diào)節(jié)羥基磷灰石在懸浮液中的含量來改變材料懸浮液的黏度和穩(wěn)定性，通過SLA裝置構(gòu)建出定制化的骨組織替代材料，證明以SLA技術(shù)制造骨組織工程支架是可行的。Ronca等[13]采用微立體光刻技術(shù)和計算機輔助技術(shù)制備了外消旋聚乳酸/納米羥基磷灰石（PDLLA/nano-Hap）復(fù)合樹脂薄膜，在PDLLA和丙烯酸酯產(chǎn)生的光交聯(lián)反應(yīng)中調(diào)節(jié)nano-Hap與光引發(fā)劑的含量，并探究了nano-Hap對該樹脂薄膜的流變和光化學(xué)性質(zhì)的影響，對材料的機械性能、熱力學(xué)性能和形態(tài)屬性進行測試，發(fā)現(xiàn)隨著納米粒子含量的增加，材料的剛度也隨之增加。Elomaa等[14]利用快速成型技術(shù)交聯(lián)聚己內(nèi)酯（polycaprolactone, PCL）和生物活性玻璃，其中生物活性玻璃均勻地分布于PCL支架的孔洞及表面。將該支架置于模擬體液（simulated body fluid，SBF）中并進行離子釋放測量，結(jié)果顯示鈣和磷濃度迅速降低，表面存在的磷酸鈣使支架具有生物活性，生物活性玻璃的存在能增強成纖維細(xì)胞的代謝活動。該實驗證明，通過SUA立體印刷技術(shù)能制備高精度的復(fù)合支架，均勻分布于支架表面的生物活性玻璃能促進離子釋放和細(xì)胞的相互作用。

雖然該技術(shù)分辨率高、性能穩(wěn)定、成型范圍大，但成型產(chǎn)品需要清洗除去雜質(zhì)。具有生物活性的骨骼類替代材料如生物玻璃、透明質(zhì)酸（HA）等材料并非光敏性材料，需要與光敏材料混合改性后才能使用，因此成品的性能與原材料相比往往差別較大，此技術(shù)的應(yīng)用范圍也受到較大的限制。

1.2 熔融沉積成型

熔融沉積成型（FDM）是采用熔融擠出的概念擠出一系列平行的絲材，通過形成一層層的絲材來制造模型[9]。該技術(shù)一般采用熱塑性材料，由噴頭加熱后熔融擠出，并在室溫或指定溫度下迅速冷卻固化直至成型。打印時若用到支撐材料則需要后處理除去支撐材料，最后得到成品，其原理與SLA技術(shù)類似[15]。

目前應(yīng)用于FDM的材料主要包括聚乳酸（polylactic acid,PLA）[16-17]、PCL[18-19]、聚乳酸-羥基乙酸（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）[19]等高分子材料。Casavola等[16]對FDM進行了研究，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在正交各向異性，并且隨著填充間距的增大，支架的力學(xué)性能呈下降趨勢；對PLA和丙烯腈兩種材料的彈性模量進行測量和分析發(fā)現(xiàn)，其彈性模量的特征符合經(jīng)典層合板理論。Kim等[19]則采用新穎的PCL/PLGA混合材料通過多噴頭系統(tǒng)打印出組織工程材料。該材料形態(tài)規(guī)則，孔洞貫通性良好，孔徑約為600 μm，絲材直徑為200 μm，孔隙率約為69.6%。壓縮強度和模量分別為0.8和12.9 MPa，足以維持體外細(xì)胞試驗。該技術(shù)在骨組織工程中的應(yīng)用較為廣泛，與纖維粘結(jié)法、粒子浸出法、溶劑澆注法和冷凍干燥法等相比，F(xiàn)DM為物理過程，不需要添加溶劑，無有毒成分殘留，無須后加工處理，能夠最大限度地保證材料的原有特性[20]。對于骨組織替代材料來說，高孔隙率有利于新生細(xì)胞和血管的長入，有利于組織的再生和修復(fù)，但是高孔隙率必然導(dǎo)致力學(xué)性能下降，因此尋找合適的骨替代材料是該領(lǐng)域亟待解決的問題[21]。

1.3 選擇性激光燒結(jié)

選擇性激光燒結(jié)（SLS）是根據(jù)計算機的路徑采用激光束按照逐點掃描，使工作臺上的粉末原料經(jīng)高溫熔融并固化。第一步完成后，同樣沿Z軸移動工作臺，在已固化的表面鋪上原料，逐層掃描并與下方已固化的材料粘合在一起，最終形成三維材料。Chen等[22]用水凝膠和膠原對PCL進行改性后，利用SLS技術(shù)制成PCL支架，并對其力學(xué)和生物學(xué)性能進行評價。與單純的PCL支架相比，水凝膠和膠原的添加提高了支架的親水吸水性能和力學(xué)性能，同時提高了軟骨組織中細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。該課題組將軟骨支架植入雌性裸鼠背部的皮下部位，8周后通過組織切片和免疫組化法檢測到了新生軟骨的形成，證明通過SLS技術(shù)制成的改性PCL支架可促進新生軟骨形成且有望應(yīng)用于顱面整形。Duan等[23]以Ca-P/聚羥基丁酯戊酯（PHBV）和CHAp/聚乳酯（PLLA）復(fù)合材料為原料，通過SLS技術(shù)制成了三維納米復(fù)合材料微球。該方法燒結(jié)而成的支架具有規(guī)則的微觀結(jié)構(gòu)、貫通的多孔形貌和較高的孔隙率。通過與人成骨肉瘤細(xì)胞（SaOS-2）共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，Ca-P的存在能夠顯著提高細(xì)胞的增殖能力。該支架為成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化提供了合適的環(huán)境，在骨組織工程領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力。Du等[24]首先通過改良的溶劑蒸發(fā)法制備出粒徑均一的PCL和PCL/HA微球，再以此為原料通過SLS技術(shù)制備一系列具有均一孔洞、合適的力學(xué)性能和良好的生物相容性的三維骨支架。該支架能夠促進多種干細(xì)胞的增殖、分化，并體現(xiàn)出良好的組織相容性和誘導(dǎo)血管生成能力，說明SLS技術(shù)是制備仿生骨材料行之有效的方法。SLS技術(shù)使用的材料主要包括塑料、陶瓷以及金屬粉末等[25-26]。其優(yōu)點是無須支撐材料；缺點是加工過程中易產(chǎn)生粉塵和有毒氣體，且高溫容易導(dǎo)致材料降解、生物活性分子變形及細(xì)胞的凋亡[2]。

1.4 三維噴印

三維（3D）噴印技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的3D打印技術(shù)。與SLS技術(shù)類似，首先在平臺上鋪一層粉末材料，通過計算機控制路徑將液態(tài)粘結(jié)劑噴在粉末材料上，在指定區(qū)域噴上粘結(jié)劑使材料粘結(jié)，再使工作臺沿Z軸下降一層材料的高度，并重復(fù)之前的操作方法逐層粘結(jié)，形成三維打印產(chǎn)品。該方法與SLS相同，在打印完成后均需將模型從未粘結(jié)的粉末中分離出來。Serra等[27]以PLA和Ca-P為原料通過3D噴印技術(shù)制造出兩種不同堆積方式的組織工程支架（分別為正交和錯列形貌）。通過掃描電鏡和顯微計算機斷層掃描（micro-CT）觀察到該支架內(nèi)部孔洞貫通，形貌規(guī)整，Ca-P粒子分布均勻，且通過表面性能測試證明了Ca-P粒子的存在提高了支架的粗糙度和表面親水性。力學(xué)性能測試表明，壓縮強度與支架形貌和Ca-P粒子存在與否有關(guān)，細(xì)胞實驗顯示Ca-P粒子能夠提高骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞的附著能力。該實驗表明3D噴印適用于多孔支架的制造并能夠保留材料原有的生物相容性，可用于組織工程的應(yīng)用研究。

Zhou等[28]將Ca-P和CaSO4粉末制成混合材料后利用3D噴印技術(shù)制成復(fù)合材料支架，其使用水基粘結(jié)劑確保了復(fù)合材料的可靠性和可重復(fù)性，且避免了對打印噴頭造成長期的損壞。對影響支架成形性能的關(guān)鍵工藝參數(shù)進行了評估，包括打印過程中粉末的填充、粘結(jié)劑滲透行為、支架結(jié)構(gòu)、顆粒大小、Ca-P和CaSO4的比例等。研究發(fā)現(xiàn)，在打印過程中使用粒徑為30～110 μm的Ca-P與粒徑為20 μm的Ca-P相比能夠達(dá)到更好的成形效果；隨著Ca-P/ CaSO4比例升高，壓縮強度也逐漸升高；HA/CaSO4粉末與β-磷酸三鈣（β-TCP）/CaSO4粉末相比打印效果更好。最后，該課題組經(jīng)過條件優(yōu)化后，用Ca-P/ CaSO4粉末制備出了具有合適的力學(xué)性能和高精度的組織工程多孔骨支架。

3D噴印技術(shù)的優(yōu)點為操作簡便、產(chǎn)品孔隙率高及原料的應(yīng)用范圍廣，包括聚合物、金屬和陶瓷；其缺點是產(chǎn)品的力學(xué)強度較低，需要通過后處理提高強度，但同時也會導(dǎo)致零件的變形[29]。

除上述4種技術(shù)，常見的3D打印技術(shù)還包括層全實體制造（laminated object manufacturing）、低溫沉積制造（low-temperature deposition manufacturing）、三維纖維沉積技術(shù)（3D fiber-deposition technique）以及間接快速成型法（indirect RP fabrication method）等[30-31]。3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用將為人類帶來更多的成果。

2 研發(fā)與應(yīng)用中存在的問題

2.1 材料的研發(fā)與應(yīng)用

盡管已有文獻提到了各種各樣的材料，如聚合物、陶瓷、金屬等，但從中仍可看出絕大多數(shù)材料都存在著某些難以克服的固有缺陷[2，5，10，32]。因此，尋找或開發(fā)出合適的材料是該領(lǐng)域的一大難題。近年來，生物材料是研究比較多的領(lǐng)域，其應(yīng)具有合適的機械強度以維持自身形態(tài)和承受外部所施加的力。此外，生物可降解性、可吸收性和生物相容性等也是評價其性能的重要指標(biāo)，要研發(fā)出同時具有上述性能的材料是一個巨大的挑戰(zhàn)。例如水凝膠，該材料較易成型，制備過程容易，但是力學(xué)性能低，使得其應(yīng)用范圍受到很大的限制；TCP的生物相容性好，可降解、吸收，但同樣面臨著力學(xué)性能方面的問題。未來應(yīng)著重于新型生物材料的研發(fā)，使其能夠解決上述亟待解決的問題，推動3D打印技術(shù)的進一步發(fā)展。

2.2 仿生器官的研發(fā)

隨著生活和醫(yī)療水平的提高，人體器官移植已成為一大熱點，每年等待器官移植的患者遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于捐獻器官的人數(shù)。因此，為解決此問題，科學(xué)家們都將希望寄托在3D打印技術(shù)上。目前，有少數(shù)實驗室能夠?qū)崿F(xiàn)支架材料與細(xì)胞的混合打印[33-34]，但實驗進度仍停留于簡單支架與細(xì)胞的黏合，未實現(xiàn)真正的功能化。可以說，仿生器官的功能化已成為3D打印技術(shù)的一大瓶頸[35]。

在此問題上，首先應(yīng)考慮不同種細(xì)胞間的相互作用，解決不同細(xì)胞在同一組織的存活問題?？紤]支架環(huán)境的模塊化及組織培養(yǎng)條件的兼容性等；其次是血管生成，血管的功能是為細(xì)胞提供養(yǎng)料并清除代謝廢物以維持細(xì)胞正常的生命活動，在進行仿生器官的構(gòu)建中是不可或缺的；支架的支撐與誘導(dǎo)組織修復(fù)的能力同樣不容忽視，具有優(yōu)良性能的支架可以為細(xì)胞和組織提供合適的力學(xué)環(huán)境與生長空間，促進組織的修復(fù)甚至為細(xì)胞和組織提供生命活動中所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，最大限度地提高修復(fù)效果。

總之，要實現(xiàn)仿生器官的功能化將是3D打印技術(shù)面臨的一大挑戰(zhàn)。

3 展望

本文主要介紹了3D打印技術(shù)中光固化立體印刷（SLA）、熔融沉積成型（FDM）、選擇性激光燒結(jié)（SLS）和3D噴印的工作原理、優(yōu)缺點、在骨組織工程中的應(yīng)用與存在的問題及相關(guān)的研發(fā)與應(yīng)用。盡管3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域發(fā)展迅猛，但很大一部分仍處于研究階段，將該技術(shù)推向臨床仍面臨許多挑戰(zhàn)。

在我國，利用3D打印技術(shù)進行人工骨合成、骨科術(shù)前模擬等已越來越普遍，也取得了較好的成效。余先等[36]借助3D打印技術(shù)打印出患者的股骨假體段模型以全面了解假體的損壞情況，達(dá)到盡可能地避免相關(guān)風(fēng)險問題并提高手術(shù)的精確性，降低置換風(fēng)險的目的。岳勇等[37]利用3D打印技術(shù)制作踝關(guān)節(jié)模型，制定修復(fù)方案，提高了手術(shù)的優(yōu)良率和手術(shù)效率。未來該領(lǐng)域的發(fā)展方向主要為實現(xiàn)骨替代材料在臨床醫(yī)療上的廣泛應(yīng)用以及仿生組織或器官的研發(fā)。目前，我國各大醫(yī)院、高校以及商業(yè)機構(gòu)等都已開始關(guān)注這個新興的3D打印技術(shù)并投入了大量的精力和科研經(jīng)費，相信會取得令人可喜的成果。

3D打印技術(shù)雖然已涉及多個領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景，但仍需投入大量的精力和資源來解決材料和技術(shù)方面的問題。相信通過不斷努力，在不遠(yuǎn)的將來，3D打印技術(shù)將在生物醫(yī)學(xué)工程及其他領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

利益沖突無

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Application and prospect of three-dimensional printing in bone tissue engineering

Zeng Yuting,Hong Yazhen,Wang Shibin
Department of Biological Engineering and Technology,Huaqiao University,Xiamen 361021,China

In this paper,the classification,application and advantages of three-dimensional(3D)printing in biomedical engineering are summarized.The working principles of 3D printing,stereolithography,fused deposition modeling,selective laser sintering and 3D spray printing,as well as merits,demerits and recent progress are reviewed. The 3D printing has been widely used in the synthetic of bone tissue engineering scaffolds,with biodegradable and bioactive materials in the scaffold.Synthetic bone materials and surgical simulation by 3D printing technology are increasingly common and has achieved satisfactory results in China.Although 3D printing technology has developed rapidly,development of suitable biomaterials and improving relevant techniques are still urgent issues.Up to now,the functionalization of bionic organs is the most difficult issue,in which the cell co-culture,vascularization and preparation of the scaffolds are problem to be solved.The 3D printing technology will make remarkable achievements for the regeneration and repair of human organ through our efforts.

Three-dimensional printing;Bone tissue engineering;Biomaterial;Scaffold

王士斌，Email：sbwang@hqu.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．014

國家自然科學(xué)基金（31570974）；華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新能力培育計劃資助項目Corresponding author:Wang Shibin,Email:sbwang@hqu.edu.cn

2016-02-10）