布加綜合征模型大鼠缺氧相關(guān)因子與表觀擴(kuò)散系數(shù)的變化及臨床意義

朱楠 張?zhí)鹛?成德雷

布加綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）的本質(zhì)是肝靜脈（hepatic vein，HV）回流受阻導(dǎo)致的淤血性肝損傷，若不經(jīng)治療，最終會(huì)進(jìn)展為肝硬化[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在BCS的病理?yè)p傷中，缺氧誘導(dǎo)因子-1琢（hypoxia-inducible factor-1琢，HIF-1琢）、NF-資B 扮演重要角色，其參與調(diào)節(jié)BCS肝損傷中肝星型細(xì)胞活化，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)沉積、微循環(huán)灌注等情況，這些均表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)外水分子彌散變化，從而改變MRI表觀擴(kuò)散系數(shù)（apparent diffu原sion coefficient，ADC）的水平[3-5]。在評(píng)估脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝損傷中已有ADC值應(yīng)用的報(bào)道，但在BCS中的研究為數(shù)不多[6]。因此，本研究參考文獻(xiàn)[3]結(jié)扎下腔靜脈（inferior vena cava，IVC）建立下腔靜脈梗阻型BCS模型大鼠，并動(dòng)態(tài)檢測(cè)肝臟ADC值與HIF-1琢、NF-資B水平的變化，初步探討其在BCS肝損傷中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組、建模 135只體重235～305 g的健康雄性SD大鼠購(gòu)自安徽省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在12 h明/暗交替光照下，溫度15～25益，濕度50豫～60豫條件下清潔飼養(yǎng)。按隨機(jī)數(shù)字表法分組：（1）對(duì)照組15只，僅常規(guī)飼養(yǎng)；（2）模型組 60 只（分為第 1、4、8、12 周亞組，每組15只），于劍突下正中開(kāi)腹分離肝鐮狀韌帶，暴露肝后段IVC，用3 F微導(dǎo)管平行緊貼IVC，并以0號(hào)線環(huán)繞結(jié)扎IVC后將微導(dǎo)管抽出，結(jié)扎IVC松緊度適中，逐層縫合關(guān)腹（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）；（3）假手術(shù)組60只（分為第 1、4、8、12周亞組，每組 15只），開(kāi)腹后未結(jié)扎肝后段IVC，僅作切口縫合。

圖1 模型組結(jié)扎下腔靜脈（IVC）示意圖

1.2 MRI及DSA檢查 MRI檢查：使用GE HDXT-1.5T磁共振機(jī)。對(duì)照組于第12周末，模型組及假手術(shù)組分別于建模后第1、4、8、12周末隨機(jī)取9只大鼠，晨起停飼，常規(guī)麻醉后，取仰臥位，腹部加壓固定于腕關(guān)節(jié)線圈中心，掃描參數(shù)為TR 1 250 ms，TE 65 ms，F(xiàn)OV 55 mm伊55 mm，層間距 0.2 mm，層厚 3.0 mm，反轉(zhuǎn)角90毅，激勵(lì)次數(shù) 8，矩陣 192伊192，行常規(guī) T1WI、T2WI序列檢查及仰臥軸面DWI檢查。b值取800 s/mm2，自旋回波-回波平面成像加脂肪抑制。測(cè)量ADC值，感興趣區(qū)（ROI）大小約 15耀20 mm2，盡量避開(kāi)膽管、血管及肝臟邊緣，取3個(gè)ROI測(cè)得數(shù)值的平均值。DSA檢查：各組大鼠于MRI檢查后1 d行DSA，于任意一側(cè)下肢消毒、鋪巾，以21 G靜脈留置針穿刺股靜脈，注射對(duì)比劑觀察IVC血流情況。DSA檢查后1 d，麻醉下開(kāi)腹處死大鼠，取肝臟作下述檢查。

1.3 常規(guī)病理檢查及免疫組化檢測(cè) 取MRI測(cè)量ROI相應(yīng)層面的新鮮肝組織適量，用10%福爾馬林固定24 h，石蠟包埋，制作組織切片，HE染色后行常規(guī)病理學(xué)檢查。并以PicTureTM法（PicTureTM檢測(cè)試劑，美國(guó)Zymed公司）行免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5～10 min后PBS（ZSbio公司）沖洗。滴加一抗[兔抗 HIF-1琢（1:300）、兔抗 NF-資B（1:300）]，室溫孵育30～60 min后PBS沖洗。滴加通用型IgG抗體（Fab段）-HRP多聚體，室溫孵育10～20 min后PBS沖洗，應(yīng)用DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性表達(dá)為結(jié)構(gòu)清晰的細(xì)胞質(zhì)棕黃染色。

1.4 肝組織HIF-1琢、NF-資B的mRNA表達(dá)檢測(cè) 肝組織液氮研磨后加入1 ml TRIzol勻漿，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟提取總RNA，提取出的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific公司），然后行 real-time PCR 檢測(cè) HIF-1琢、NF-資B 的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95益2 min；95益5 s，60益10 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）如下：茁-actin 上游序列：5憶-CCCATCTAT原GAGGGTTACGC-3憶，下游序列：5憶-TTTAATGTCACG原CACGATTTC-3憶；HIF-1琢 上游序列：5憶-TGACCACTGC原TAAGGCATCA-3憶，下游序列：5憶-GGCTCCTTGGAT原GAGCTTTG-3憶；NF-資B 上游序列 5憶-AAGATCTGCC原GAGTAAACCG-3憶，下游序列：5憶-TCCCGTGAAATA原CACCTCAA-3憶；基因相對(duì)表達(dá)量以 2-吟吟Ct計(jì)算。

1.5 肝組織HIF-1琢、NF-資B蛋白表達(dá)檢測(cè) 肝組織細(xì)胞裂解、離心后收集上清液，按照1:4加入5伊SDSPAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，冷卻到室溫，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，每孔5～20滋l。濃縮、分離后300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。漂洗5 min，室溫封閉 2 h。一抗[兔抗 HIF-1琢（1:300）、兔抗 NF-資B（1:300）]4 益孵育過(guò)夜，加入洗滌液（PBST），10 min/次，共 3次，相應(yīng)二抗（山羊抗兔，1:5 000）室溫孵育2 h。加入PBST洗滌液，10 min/次，共3次。使用ECL超敏發(fā)光試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，以Image J軟件分析條帶灰度值，HIF-1琢、NF-資B的蛋白相對(duì)表達(dá)量依照內(nèi)參照結(jié)果計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用兩因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，各指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCS模型大鼠建立情況 對(duì)照組存活15只，假手術(shù)組第 1、4、8、12 周亞組分別存活 15、14、15、15 只，對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠活動(dòng)如常、反應(yīng)機(jī)警，毛色光亮，DSA檢查均無(wú)陽(yáng)性表現(xiàn)。模型第1、4、8、12周亞組分別存活13、14、13、13只，存活大鼠均成功建立BCS模型，模型組大鼠術(shù)后活動(dòng)逐漸減少、反應(yīng)遲鈍，毛色灰暗，肝后段IVC管腔明顯變窄，遠(yuǎn)端擴(kuò)張，4周后逐漸見(jiàn)側(cè)支循環(huán)形成（圖2）。

圖2 模型組第12周DSA檢查所見(jiàn)[肝后段IVC管腔狹窄（短箭頭所示），遠(yuǎn)端擴(kuò)張，見(jiàn)廣泛側(cè)支循環(huán)形成（長(zhǎng)箭頭所示）]

2.2 各組大鼠MRI表現(xiàn) 各組大鼠常規(guī)T1WI、T2WI掃描肝實(shí)質(zhì)信號(hào)均勻，肝表面光整（圖3）。對(duì)照組與假手術(shù)組ADC值比較，總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.282，P=0.889）；對(duì)照組 ADC值高于模型組（F=14.213，P=0.001）；模型組ADC值低于假手術(shù)組（F=13.145，P=0.001）。模型組ADC值呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，在模型組內(nèi)各亞組整體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.275，P=0.001）；各亞組間兩兩比較，第1周亞組與第4周亞組、第1周亞組與第8周亞組、第4周亞組與第12周亞組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.001），其中以第4周亞組ADC值最低，見(jiàn)圖4（插頁(yè)）、表1。

2.3 各組大鼠HIF-1琢的mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較 對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)HIF-1琢的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于模型組（F=985.298、774.482，均 P=0.001），與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.217、0.653，P=0.315、0.627）。模型組各時(shí)點(diǎn)HIF-1琢的mRNA及蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組（F=563.814、878.432，均 P=0.001），并呈先升高后下降，各亞組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=864.961、372.287，均 P=0.001），其中以第 4 周亞組最高，見(jiàn)圖 5、表 2。

2.4 各組大鼠NF-資B檢測(cè)結(jié)果的比較 對(duì)照組NF-資B的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于模型組（F=376.254、682.548，均P=0.001）；與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.820、0.842，P=0.518、0.505，表 3）。模型組各時(shí)點(diǎn)HIF-1琢的mRNA及蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組（F=378.146、685.152，均 P=0.001），并呈先升高后下降，各亞組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=248.165、347.134，均P=0.001），其中以第4周亞組最高，見(jiàn)圖5、表3。

2.5 各指標(biāo)間相關(guān)性分析 模型組ADC值與HIF-1琢、NF-資B 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.709、-0.717，均 P=0.001）；HIF-1琢與 NF-資B 呈正相關(guān)（r=0.901，P=0.001），見(jiàn)圖 6-8。

2.6 常規(guī)病例檢查及免疫組化檢測(cè) 對(duì)照組（圖9a，見(jiàn)插頁(yè)）及假手術(shù)組（圖9b，見(jiàn)插頁(yè)）大鼠觀察至第12周HE染色均未發(fā)現(xiàn)明顯肝組織損傷。模型組（圖9c，見(jiàn)插頁(yè)）大鼠肝臟病理?yè)p傷程度逐漸加重，12周亞組最顯著，可見(jiàn)肝索破壞、肝細(xì)胞變性、萎縮、壞死，肝竇擴(kuò)張、紅細(xì)胞淤積等。對(duì)照組及假手術(shù)組觀察至第12周的HIF-1琢、NF-資B 免疫組化均無(wú)陽(yáng)性染色（圖 10a～d，見(jiàn)插頁(yè)）；模型組HIF-1琢、NF-資B陽(yáng)性染色呈棕黃色，均以第4周最顯著，主要分布于肝竇周細(xì)胞、匯管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維組織（圖10e～f，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖3 各組大鼠肝臟T1WI圖像（a：對(duì)照組第12周；b：假手術(shù)組第12周；c：模型組第12周）

表1 各組大鼠ADC值比較（×10-3mm2/s）

圖4 模型組肝臟表現(xiàn)擴(kuò)散系數(shù)（ADC）偽彩圖

圖5 各組大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1琢（HIF-1琢）、NF-資B蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組大鼠HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

圖6 缺氧誘導(dǎo)因子-1琢（HIF-1琢）與表觀擴(kuò)散系數(shù)（ADC）值相關(guān)性

圖7 NF-資B與表觀擴(kuò)散系數(shù)（ADC）值相關(guān)性

圖 8 缺氧誘導(dǎo)因子 -1琢（HIF-1琢）與NF-資B 相關(guān)性

圖9 各組大鼠肝臟組織常規(guī)病理檢查所見(jiàn)（a：對(duì)照組第12周；b：假手術(shù)組第12周；c：模型組第12周；HE染色，×200）

圖10 各組大鼠肝組織免疫組化檢測(cè)所見(jiàn)[a：對(duì)照組第12周缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）；b：假手術(shù)組第12周HIF-1α；c：對(duì)照組第12 周 NF-κB；d：假手術(shù)組第 12 周 NF-κB；e：模型組第 4 周 HIF-1α；f：模型組第 4 周 NF-κB；免疫組化染色，×200]

3 討論

DWI是反映水分子布朗運(yùn)動(dòng)情況的一項(xiàng)MRI檢查技術(shù)，其通過(guò)反映出組織間隙水分子擴(kuò)散的改變，反映出肝損傷過(guò)程中細(xì)胞外間隙的變化信息，ADC值是其主要參數(shù)[6]，可以先于肝硬化形態(tài)學(xué)的變化，幫助早期判斷BCS肝臟損傷情況[5]。BCS是肝靜脈回流障礙導(dǎo)致的肝臟淤血缺氧損傷，其最終轉(zhuǎn)歸為淤血性肝纖維化[1]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]HIF-1琢、NF-資B參與BCS肝損傷，其可造成肝細(xì)胞水腫、肝微循環(huán)障礙、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外水分子和肝臟灌注的改變，從而反映在ADC值的變化[5-6]。本研究建立大鼠BCS動(dòng)物模型，在BCS病程的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了ADC值、HIF-1琢、NF-資B的變化，發(fā)現(xiàn)3者呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，提示其存在相關(guān)性，并可從一定程度上反映BCS肝臟淤血缺氧的嚴(yán)重程度。

HIF-1琢是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，其在缺氧期間可呈現(xiàn)高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟淤血缺氧損傷[7-8]。NF-資B是與免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子B位點(diǎn)特異性結(jié)合的核蛋白因子，缺氧時(shí)，可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞在各種類型的肝損傷及肝纖維化中發(fā)揮作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組各時(shí)間點(diǎn)HIF-1琢、NF-資B水平均高于對(duì)照組及假手術(shù)組，且呈正相關(guān)，提示其可能相互調(diào)節(jié)并參與了BCS模型肝損傷的進(jìn)展。但模型組HIF-1琢、NF-資B水平并未持續(xù)升高，而是先升后降（第4周最高），這不同于其他原因肝病中隨肝損傷進(jìn)展持續(xù)上升的報(bào)道[8，10-11]，說(shuō)明其誘導(dǎo)BCS肝損傷的機(jī)制與其他類型肝病有所不同，可能是肝臟淤血缺氧后上調(diào)HIF-1琢表達(dá)，激活其下游TGF-茁1、PDGF-B等促纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)NF-資B合成、釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激損傷，致使其在第4周表達(dá)水平最高[10，12]；4周后，側(cè)支循環(huán)逐漸形成，緩解門靜脈壓力及淤血缺氧，從而下調(diào)HIF-1琢、NF-資B水平，但其始終高于正常，且肝臟病理?yè)p傷仍緩慢進(jìn)展，說(shuō)明僅靠側(cè)支循環(huán)無(wú)法從根本解決BCS淤血性肝損傷[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組ADC值低于對(duì)照組及假手術(shù)組，說(shuō)明BCS肝組織存在水分子彌散受限；模型組的ADC值先下降后上升（4周最低），這不同于脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝病中隨肝損傷進(jìn)展持續(xù)下降的報(bào)道[14-15]，這可能是因?yàn)殡S著IVC結(jié)扎時(shí)間延長(zhǎng)，前4周肝淤血缺氧加重，肝靜脈回流受阻導(dǎo)致微循環(huán)障礙，減弱水分子擴(kuò)散能力和微循環(huán)灌注，肝細(xì)胞線粒體腫脹[5]，同時(shí)氧化損傷蛋白質(zhì)、DNA生物大分子，改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，降低ADC值[5，16]，故而4周時(shí)ADC值最低，表現(xiàn)出與HIF-1琢、NF-資B呈負(fù)相關(guān)。另一方面，肝淤血缺氧后引發(fā)HIF-1琢持續(xù)高表達(dá)及氧自由基增加，激活NF-資B及TGF-茁1信號(hào)，導(dǎo)致其下游靶基因的激活和HSC的活化，上調(diào)PDGF-B等因子的表達(dá)，抑制ECM降解[10-12]，加重門靜脈高壓、肝細(xì)胞腫脹、肝竇淤血，影響水分子擴(kuò)散，從而降低ADC值，以上提示BCS肝淤血缺氧損傷程度與ADC值密切相關(guān)。

模型組在4周后逐漸建立側(cè)支循環(huán)，減輕門靜脈壓力，緩解淤血缺氧及氧化應(yīng)激，下調(diào)HIF-1琢、NF-資B表達(dá)[10-12]，提示側(cè)支血管從一定程度上緩解了肝臟淤血缺氧及微循環(huán)障礙，改善細(xì)胞外基質(zhì)沉積及水分子擴(kuò)散，從而升高 ADC值，并下調(diào)HIF-1琢、NF-資B水平，這提示ADC值與HIF-1琢、NF-資B呈負(fù)相關(guān)，3者的變化均與淤血缺氧程度密切相關(guān)。然而，4周后模型組的HIF-1琢、NF-資B水平雖有下調(diào)，ADC值雖升高，但始終未達(dá)到正常水平，說(shuō)明側(cè)支循環(huán)雖部分緩解了BCS淤血缺氧，但病理?yè)p傷仍隨IVC結(jié)扎時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢進(jìn)展，這與大量臨床報(bào)道相符[1，13]，說(shuō)明只有介入開(kāi)通梗阻靜脈才是治療BCS的根本手段。

本研究的局限性在于大鼠肝臟體積較小，呼吸運(yùn)動(dòng)及肺底和腹腔氣體等均可能影響ADC值及病理取材的準(zhǔn)確性。另外，大鼠生命周期有限，尚無(wú)法完美模擬人類中長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年的BCS病程。

綜上所述，IVC阻塞后隨著肝臟淤血缺氧進(jìn)展，ADC值與HIF-1琢、NF-資B在BCS動(dòng)物模型中的肝臟中呈負(fù)相關(guān)，3者均與淤血缺氧程度密切相關(guān)，可作為無(wú)創(chuàng)評(píng)估BCS肝損傷的一個(gè)新的選擇。