HPLC法測(cè)定生物羊膜浸泡5—氟尿嘧啶藥物吸收量

周揚(yáng)　趙爽　張晨明

[摘要]目的 建立生物羊膜（面積為8mm×10mm）中5-氟尿嘧啶（5-Fu）濃度的HPLC測(cè)定法以觀察不同浸泡時(shí)間生物羊膜浸泡5-Fu藥物吸收量。 方法 色譜柱為Diamonsil（鉆石）C18（4.6mm×250mm，5?m），流動(dòng)相為甲醇-水（2︰98），流速為1.0mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為266nm，生物羊膜吸收液為5-氟尿嘧啶注射液（標(biāo)示量為10mL；0.25g），吸收后用流動(dòng)相提取，進(jìn)樣測(cè)定。 結(jié)果 以5-氟尿嘧啶峰面積為縱坐標(biāo)，5-氟尿嘧啶濃度為橫坐標(biāo)，5-Fu在2～100?g/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9995），浸泡5min，吸收5-Fu為59.004μg/片，浸泡5min，吸收5-Fu為75.839μg/片。 結(jié)論 生物羊膜能夠吸附一定量的5-氟尿嘧啶，通過(guò)測(cè)定羊膜中吸收的5-氟尿嘧啶的量，為臨床以及基礎(chǔ)合理用藥提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法；5-氟尿嘧啶；生物羊膜

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2016）01-42-03

[Abstract]Objective To establish a HPLC method for determination the concentration of 5-fluorouracil（5-Fu） in biological amniotic membrane （area was 8mm×10mm） to observe the absorption of 5-Fu different soaking time in biological amniotic membrane. Methods Determination was achieved on a Diamonsil （diamonds） C18 （4.6mm×250mm， 5 ?m） with the mobile phase of methanol-water （volume ratio of 2︰98）. The flow rate was 1.0mL/min， the UV detection wavelength was set at 266nm and biological amniotic membrane absorption liquid for 5-Fu injection （mark is 10mL， 0.25g）. The sample was detercted after absorption. Results Ordinate was 5-Fu peak area and abscissa was the concentration of 5-Fu. The linear relationship of 5-Fu in 2-100 ?g/mL concentration range was good （r=0.999 5）. 5min immersion， absorbing 5-FU for 59.004μg/piece， soak 5 minutes， absorbing 5-FU for 75.839μg/piece. Conclusion Biological amniotic membrane can absorb a certain amount of 5-FU.By determinating amount of 5-FU absorbed in the amniotic membrane， provide the basis for clinical and rational use of drugs.

[Key words] High performance liquid chromatography； 5-FU； Biological amniotic membrane

羊膜來(lái)源于胚胎。由于沒(méi)有人體白細(xì)胞抗原的表達(dá)，其抗原性很低，無(wú)血管、神經(jīng)和淋巴管。羊膜上皮細(xì)胞具有分化的潛能，在特定條件下可分毛囊上皮和皮膚上皮，對(duì)促進(jìn)上皮愈合和降低基質(zhì)炎癥及潰瘍發(fā)揮作用[1-3]。

5-氟尿嘧啶是一種抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶、阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷酸，干擾DNA的合成，此外尚能抑制RNA的形成。5-氟尿嘧啶通過(guò)無(wú)特異性地抑制細(xì)胞，減少濾過(guò)道瘢痕形成，從而抑制成纖維細(xì)胞增生，有利于功能性濾過(guò)泡的形成和保持，使術(shù)后眼壓保持較好，提高手術(shù)成功率而用于青光眼手術(shù)[4]。5-氟尿嘧啶對(duì)角、結(jié)膜細(xì)胞有毒性作用，可導(dǎo)致淚膜功能明顯受損，表現(xiàn)為淚液分泌量減少，淚膜穩(wěn)

定性下降，易患干眼癥。因此在使用時(shí)要正確掌握用藥適應(yīng)證、嚴(yán)格控制安全使用劑量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將羊膜在5-氟尿嘧啶注射液中浸泡，采用高效液相方法對(duì)羊膜吸收的5-氟尿嘧啶含量進(jìn)行測(cè)定[5]。

1 儀器與藥品

Waters高效液相色譜儀（Waters2695）KFP-486GE/F，Empower工作站，Waters2996紫外檢測(cè)器，干燥器，梅特勒-托利多AX205 Delta Range 電子天平（瑞士梅特勒公司），XW-80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

5-氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：08052897），5-Fu注射液（標(biāo)示量為10mL；0.25g，上海旭東海普藥業(yè)有限公司），生物羊膜（江西瑞濟(jì)生物工程技術(shù)有限公司），甲醇為色譜純（批號(hào)：LOT H02E73，美國(guó)J.T.Baker公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil（鉆石）C18色譜柱（5?m，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相：甲醇-水（2︰98）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20?L；檢測(cè)波長(zhǎng)：266nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱量5-氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品0.0103g，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度得1mg/mL母液。然后從中精密量取1mL置于另一10mL容量瓶中，用流動(dòng)相（甲醇-水2︰98）稀釋至刻度，得100?g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)相稀釋，分別配置2，5，10，20，50，100?g/mL標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，分別進(jìn)樣20?L，連續(xù)進(jìn)樣5次。以5-氟尿嘧啶的峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，得直線方程為Y=6.37×104X+3.59×104，r=0.9995。表明5-氟尿嘧啶在2～100?g/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取5-氟尿嘧啶對(duì)照品，分別制成低、中、高3種不同濃度（5，20，80?g/mL）的對(duì)照品溶液，各連續(xù)進(jìn)5次。同樣方法做3d，記錄5-氟尿嘧啶峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD%值。見(jiàn)表1。

2.5 樣品測(cè)定

取生物羊膜（面積為8mm×10mm）放入2mL 5-氟尿嘧啶注射液（標(biāo)示量為10mL；0.25g）中浸泡，其中生物羊膜的數(shù)量為20個(gè)，10個(gè)浸泡5min，10個(gè)浸泡10min。將羊膜取出后，加流動(dòng)相1.0mL，漩渦混勻2min，離心，取上清液，進(jìn)樣20μL，記錄峰面積。記錄峰面積帶入上述方程中，求得羊膜吸收的量。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)5-氟尿嘧啶的物理和化學(xué)性質(zhì)（即5-Fu在水中略溶，在乙醇中微溶，在氯仿中幾乎不溶，在稀鹽酸或氫氧化鈉溶液中微溶）初步選定流動(dòng)相為甲醇-水。又以各種體積比的甲醇-水（2︰98，5︰95，10︰90，15︰85，20︰80）進(jìn)行色譜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以2︰98甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，所得5-氟尿嘧啶的峰形，峰高最佳。故最終選擇2︰98的甲醇-水作流動(dòng)相[6-8]。

3.2 5-氟尿嘧啶的提取

文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)5-氟尿嘧啶的提取應(yīng)用乙酸乙酯提取，離心取上清液，吹干后復(fù)溶[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羊膜在注射液中浸泡后，用流動(dòng)相提取的效果比乙酸乙酯提取的效果好，峰面積更大，故本次試驗(yàn)5-氟尿嘧啶的提取用流動(dòng)相，此法簡(jiǎn)便，省時(shí)。

3.3 羊膜吸收量與浸泡時(shí)間

本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，浸泡5min的羊膜吸收5-氟尿嘧啶的量比浸泡10min的羊膜吸收的5-氟尿嘧啶的量少，說(shuō)明羊膜吸收量與浸泡時(shí)間相關(guān)。但由于羊膜數(shù)量較少，未能計(jì)算出精確的比例關(guān)系，若想進(jìn)一步求證，還需較多數(shù)量的羊膜進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 藥物復(fù)合型羊膜的應(yīng)用前景

羊膜抗原性甚微[11-12]，同時(shí)具有清除炎性細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)和血管化的作用，可以減少創(chuàng)面的瘢痕增生[12-13]。利用羊膜的生物學(xué)特點(diǎn)，通過(guò)生物工程技術(shù)手段，人為改變羊膜特定的結(jié)構(gòu)（去羊膜上皮細(xì)胞或改變上皮細(xì)胞性質(zhì)）及成分（吸附特定的藥物，使羊膜原有化學(xué)成分發(fā)生變化），使其在保持羊膜基本生理特性的同時(shí)賦予其更多的生物學(xué)功能，我們稱其為羊膜的生物學(xué)改良，過(guò)去已經(jīng)有關(guān)于羊膜吸附氧氟沙星等藥物的報(bào)道[14-15]。 新鮮羊膜通過(guò)冷凍干燥技術(shù)、鈷60輻照滅菌等操作步驟制成生物羊膜，是一種透明的、有一定韌性且無(wú)神經(jīng)、血管和淋巴管的組織，保持了羊膜原有的組織結(jié)構(gòu)、原有的基本化學(xué)組成、適用于臨床要求的組織韌性和生理pH值、含水量低適于常溫長(zhǎng)期保存。經(jīng)過(guò)對(duì)生物羊膜的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，羊膜基底膜富含膠原纖維和網(wǎng)狀纖維，交織排列成網(wǎng)狀，網(wǎng)孔間隙約0.5～15?m[8]，能容納大量藥物 ，可吸附藥液作為“藥庫(kù)”，且因膠原降解時(shí)間較慢，所以可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)逐步釋放出藥物，并維持較長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)維持局部有效藥物濃度，成為良好的膜控半定量釋藥系統(tǒng)。任何微粒大小小于生物羊膜微孔的物質(zhì)均能被儲(chǔ)存其中。我們將生物羊膜置于25g/L 5-Fu溶液中，生物羊膜中也就儲(chǔ)存了一定數(shù)量的5-Fu，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，生物羊膜可以吸附一定量的5-Fu，同時(shí)羊膜吸收量與浸泡時(shí)間相關(guān)。因此，我們認(rèn)為在能夠?qū)⑦@種藥物復(fù)合型的羊膜應(yīng)用到小梁切除術(shù)中，生物羊膜在鞏膜瓣下被逐漸的溶解和吸收，儲(chǔ)存其中的5-Fu被逐漸的稀釋和釋放出來(lái)，與生物羊膜一起發(fā)揮抑制濾過(guò)通道細(xì)胞增殖的作用，因此可以認(rèn)為生物羊膜在本研究中起到了“天然緩釋裝置”的作用。這將大大提高青光眼手術(shù)的成功率。

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（收稿日期：2015-10-19）