血吸蟲病實驗診斷的研究現(xiàn)狀

王雪峰 綜述,蔡愛玲,周明莉 審校

(湖北省血吸蟲病診療中心,湖北荊州 434000)

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血吸蟲病實驗診斷的研究現(xiàn)狀

王雪峰 綜述,蔡愛玲,周明莉△審校

(湖北省血吸蟲病診療中心,湖北荊州 434000)

關(guān)鍵詞:血吸蟲病；病原學(xué)檢測；免疫學(xué)檢測；核酸檢測

血吸蟲病是一種人畜共患寄生蟲病。血吸蟲感染引起的肝臟纖維化，最終可導(dǎo)致患者繼發(fā)門脈高壓征等嚴(yán)重后果，使患者喪失勞動能力、生活自理能力、甚至死亡[1-3]。據(jù)報道，全球76個國家和地區(qū)有血吸蟲病流行，受到不同程度感染的人群達(dá)2億[4]。血吸蟲病的控制和消滅是一項長期而艱巨的任務(wù)，需進(jìn)一步加大傳染源控制力度[5-6]，提高診斷能力。目前血吸蟲病實驗診斷可分三大類，分別為病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和核酸診斷。本文就近幾十年來發(fā)展的血吸蟲實驗室診斷的研究現(xiàn)狀介紹如下。

1病原學(xué)檢測

1.1糞便檢查從糞便中查見蟲卵或孵出毛蚴，是確診的依據(jù)。

1.1.1直接涂片法直接涂片后在顯微鏡下檢查有無血吸蟲蟲卵。其檢出率低，在急性血吸蟲患者的黏液血便內(nèi)較易查到蟲卵。

1.1.2加藤厚涂片法和改良加藤厚涂片法其檢出率高于直接涂片法，可計算每克糞便中的蟲卵數(shù)。在人群感染率5%以上的地區(qū)，可用作常規(guī)查病方法和考核防治效果。

1.1.3自然沉淀法利用血吸蟲卵比重較大、易于沉淀的特點，將糞便沉淀一定時間后，將沉渣在顯微鏡下涂片鏡檢觀察有無血吸蟲蟲卵。此法檢出率高于直接涂片法。

1.1.4尼龍袋集卵法將糞便調(diào)漿后置于上方的40～60目尼龍絹袋和下方的260目尼龍絹袋中，淋水沖洗袋內(nèi)糞渣，使血吸蟲蟲卵集中在下方尼龍絹袋中，在顯微鏡下鏡檢觀察沉渣中有無血吸蟲蟲卵。其檢出率與自然沉淀法相近或稍高。操作簡單，可縮短集卵時間，便于現(xiàn)場查病及大規(guī)模檢查。

1.1.5毛蚴孵化法常用三角燒瓶孵化法。由于成熟日本血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度、光線下，在孵化水中可以很快孵出，并在水中游動，根據(jù)毛蚴的水中運動特征觀察結(jié)果。但應(yīng)區(qū)分孵化水中的原生動物、其他微生物或離子，導(dǎo)致假性實驗結(jié)果或干擾結(jié)果判定[7]，從而得出假陽性結(jié)果。用自然沉淀法、尼龍袋集卵法收集的沉渣作孵化實驗可提高檢出率。在血吸蟲低感染度地區(qū)，主要采用毛蚴孵化法。目前，普遍結(jié)合使用，稱為沉淀孵化法和尼龍袋集卵孵化法，其檢出率明顯高于糞便查血吸蟲卵的各種方法。2011年起，在《全國血吸蟲病監(jiān)測方案》中，首次將尼龍絹集卵孵化法作為全國監(jiān)測點病原學(xué)檢查的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[8]。

1.2腸黏膜活組織檢查通過直腸鏡或乙狀結(jié)腸鏡夾取可疑含蟲卵結(jié)節(jié)的黏膜組織，壓片鏡檢。根據(jù)形態(tài)或組織化學(xué)染色法鑒別蟲卵死活。腸黏膜組織內(nèi)查見活卵、近期變性卵可作為治療的依據(jù)。但腸黏膜活組織檢查有創(chuàng)傷性，具有一定的危險，無療效考核價值。

2免疫學(xué)檢測

2.1間接紅細(xì)胞凝集試驗(IHA)將血吸蟲可溶性蟲卵抗原吸附于綿羊紅細(xì)胞或人O型紅細(xì)胞表面，使其成為致敏紅細(xì)胞，致敏紅細(xì)胞與患者血清中抗體相遇時，在適宜條件下，紅細(xì)胞表面吸附的抗原和特異性抗體相結(jié)合，形成肉眼可見的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。

2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清內(nèi)含特異性抗體或抗原與載體上抗原或抗體特異性結(jié)合的試驗方法，其敏感性高、特異性強(qiáng)，陽性符合率為97.6%左右，假陽性率約為2.6%，是現(xiàn)今檢查血吸蟲病的主要免疫診斷方法。由于血吸蟲循環(huán)抗原沒有種屬特異性，因此這些方法不能區(qū)分感染的蟲種[9]。

2.3膠體染料試紙條法試驗(DDIA)利用膠體染料標(biāo)記蟲卵抗原(SEA)，通過層析法進(jìn)行檢測。具有高度敏感性，與其他寄生蟲病的交叉反應(yīng)率很低。該法適合于大規(guī)模的血吸蟲患者群的篩選，操作方便易行。

2.4環(huán)卵沉淀試驗(COPT)COPT為血吸蟲病檢測的特有方法，此法的缺點為反應(yīng)時間較長，需在48～72 h后才能觀察結(jié)果。在低度流行區(qū)的曼氏血吸蟲病檢測中，COPT被認(rèn)為是診斷血吸蟲病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。

2.5斑點金免疫滲濾試驗該檢測方法以硝酸纖維膜為載體，紅色膠體金為標(biāo)記物，定性檢測人血清中的血吸蟲蟲卵抗體。其方法具有較高的敏感性，操作簡便快捷，整個試驗不需要特殊的儀器設(shè)備，適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查,又能作為個別病例單份檢測的免疫學(xué)診斷工具[11-12]。

2.6皮內(nèi)試驗皮內(nèi)試驗屬Ⅰ型或Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)受試者皮內(nèi)注射少量血吸蟲抗原后，如受試者感染血吸蟲，抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，血管活性物質(zhì)釋放，局部組織呈現(xiàn)紅腫反應(yīng)，即該試驗為陽性。該法具有早期診斷價值，但無療效考核價值，適用于流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場篩選。

2.7間接熒光抗體試驗(IFA) 先制作成切片抗原，將血吸蟲病鼠的肝組織切片后附在載玻片上，-20 ℃條件下保存，試驗前先將抗原片在室溫下復(fù)溫至少30 min，將熒光素與抗免疫球蛋白抗體結(jié)合，制備成熒光素標(biāo)記的第二抗體。利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點，在熒光顯微鏡下觀察試驗結(jié)果。該方法特異性好且敏感性高。

3核酸檢測

3.1普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用PCR技術(shù)直接探查針對病原體來源的核酸片段，可確定有無病原體感染，該法特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好，易自動化，是一種較理想的基因診斷技術(shù)。

3.2降落PCR降落PCR是一種改良PCR，包括變性和退火兩個步驟，Suzuki等[13]報道：應(yīng)用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，與其他感染人的血吸蟲無交叉反應(yīng)。在小鼠感染模型中，6周ELISA才能在血清中檢測到抗成蟲及抗蟲卵IgG抗體，感染8周后糞便中才能查到蟲卵，而降落PCR于感染2周后血清中就可以檢測到，具有很好的早期診斷價值，同時由于該方法直接用血清標(biāo)本作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無需血清標(biāo)本DNA的抽取，使其更具有實用價值。

3.3多重PCR多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一反應(yīng)體系里加入兩對或多對引物，同時擴(kuò)增出多個針對病原體的核酸片段，具有高效、高產(chǎn)率、能降低實驗成本、加速實驗進(jìn)程等優(yōu)點[14]。Gobert等[15]曾報道：該方法與病原學(xué)檢測方法高度相關(guān)，敏感性和特異性可分別達(dá)到87.7%和100%。

3.4巢式PCR巢式PCR試驗中有兩對引物，對第一對外引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，其擴(kuò)增片段與普通相似，將第二對內(nèi)引物結(jié)合在第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物內(nèi)部，這樣第二輪PCR擴(kuò)增片段短于第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物。由于使用了兩對引物進(jìn)行了兩輪PCR擴(kuò)增，這樣增加了檢測的敏感性和可靠性[16]。劉愛平等[17]報道：該方法具有極高的敏感性，在僅存在3～5 對成蟲感染的家兔血清中就能擴(kuò)增到特異性目的條帶，感染后3 d就可檢測到?？捎糜谌毡狙x低感染度宿主血清的檢測，具有潛在的應(yīng)用前景。

3.5實時熒光定量PCR該法能對起始模板定量及定性分析，是PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高度靈敏的核酸定量檢測技術(shù)，因其實時、準(zhǔn)確、定量、高度重復(fù)性、無需進(jìn)行凝膠電泳的特點，在疾病檢測方面頗受關(guān)注[18]，至今在其他領(lǐng)域行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。

3.6PCR-ELISAPCR-ELISA是一種在PCR擴(kuò)增后借用ELISA的原理，使用酶標(biāo)抗體，通過固相或液相雜交來實現(xiàn)定量檢測的一種技術(shù)，具有PCR技術(shù)的高敏感性、核酸探針的特異性、酶標(biāo)儀直接讀取結(jié)果的客觀性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)主要包括3個部分：PCR、擴(kuò)增產(chǎn)物與探針的雜交、常規(guī)的ELISA酶標(biāo)顯色。Comes等[19]報道：最小檢測限可達(dá)1.3 pg的基因組DNA，且與其他種屬的血吸蟲基因組不發(fā)生交叉反應(yīng)，其檢測的敏感性和特異性分別可達(dá)97.4%和85.1%。

3.7環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)LAMP是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳等過程，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫(60～65 ℃)條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，1 h左右完成，可直接肉眼判讀結(jié)果。LAMP具有簡單快速、檢測成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點，且與曼氏血吸蟲、肝吸蟲無種屬交叉反應(yīng)。該技術(shù)不依賴任何專門的儀器設(shè)備，不同于其他核酸檢測方法，可以實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測?，F(xiàn)已被應(yīng)用于非洲錐蟲病、惡性瘧原蟲、甲型肝炎和一些魚類寄生蟲或病毒的診斷，從而為LAMP在日本血吸蟲病的診斷和療效考核中的應(yīng)用提供了一種新的有效方法[20-22]。

43種實驗室檢測方法的比較

4.1病原學(xué)檢測方法病原學(xué)檢測方法敏感性低、漏檢率高，但為血吸蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是確診血吸蟲病的重要依據(jù)。糞便直接涂片法操作簡單，但蟲卵檢出率低；毛蚴孵化法可提高急性血吸蟲病感染的檢出率；直腸鏡活組織檢查主要針對慢性特別是晚期血吸蟲病感染者，有助于發(fā)現(xiàn)沉積于腸黏膜內(nèi)的蟲卵。

4.2免疫學(xué)檢測方法

4.2.1抗體檢測如COPT、IHA、ELISA、膠體金試紙條法(DDIA)等，雖具有較高的敏感性和特異性，但不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，因此抗體檢測用于血吸蟲感染的臨床診斷和療效考核并不理想[23]，不能作為血吸蟲病確診依據(jù)，常出現(xiàn)過度化療的狀況,但可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查、防治效果評價和消除驗證。

4.2.2抗原檢測從理論上講可以作為確定現(xiàn)癥感染的理想方法，但是從已發(fā)展的應(yīng)用單克隆抗體檢測血吸蟲循環(huán)抗原的諸多方法的應(yīng)用效果來看，并不理想，對慢性患者的檢出率低、特異性差，無法滿足血吸蟲病診斷的需求。

4.3核酸檢測方法近年發(fā)展了多種核酸檢測方法，如核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等，均具有很好的敏感性和特異性，顯示了廣泛的應(yīng)用前景，但因靶序列的選擇、實驗場所和專業(yè)儀器設(shè)備的限制暫未得到現(xiàn)場大規(guī)模普及應(yīng)用。血吸蟲的成蟲寄生在宿主腸系膜靜脈中，其不斷排出的蟲卵沉積在肝臟門靜脈系統(tǒng)及腸系膜靜脈中，死亡的成蟲或蟲卵的崩解產(chǎn)物及蟲體生長發(fā)育過程中表膜脫落物將不斷釋放其核酸片段，可出現(xiàn)在宿主的糞便、血液、尿液及其他一些標(biāo)本中。因此，通過檢測這些核酸片段即可診斷血吸蟲的感染。迄今為止，國內(nèi)外研究人員已進(jìn)行了很多的研究。

臨床上因為血吸蟲病的癥狀不典型，缺乏特異性的檢測手段，如特異性血清學(xué)檢查和影像學(xué)檢查，早期糞便蟲卵檢測亦可為陰性，故臨床上早期確診率低、誤診率高[24]，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的重視。目前，經(jīng)過多年有效防治我國的血防工作取得了舉世矚目的成績，大部分血吸蟲病流行區(qū)已經(jīng)被消滅或控制，但形勢依然嚴(yán)峻[25-27]。目前我國許多血吸蟲病流行地區(qū)處于低度傳播或低度流行狀態(tài)，這種流行態(tài)勢對目前流行區(qū)常用診斷方法的可靠性提出了挑戰(zhàn)，并對現(xiàn)有診斷方法的改進(jìn)或新診斷方法的研發(fā)提出了新的需求。現(xiàn)階段需要更高敏感性、特異性的診斷方法，為血吸蟲病的診斷、治療和療效考核提供依據(jù)，為及時修訂與出臺相應(yīng)的防控策略提供保障。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.030

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1824-03

(收稿日期：2016-03-02修回日期：2016-05-12)

△通訊作者,E-mail：421981727@qq.com。

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