血清差異蛋白補體C3f和脫精氨酸-C3f的研究現(xiàn)狀*

劉　偉 綜述,王世鑫 審校

(1.天津市第二人民醫(yī)院檢驗科/天津市肝病研究所　300192;2.天津市西青區(qū)西青醫(yī)院　300380)

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·綜述·

血清差異蛋白補體C3f和脫精氨酸-C3f的研究現(xiàn)狀*

劉偉1綜述,王世鑫2△審校

(1.天津市第二人民醫(yī)院檢驗科/天津市肝病研究所300192;2.天津市西青區(qū)西青醫(yī)院300380)

關(guān)鍵詞:補體系統(tǒng)；C3f；脫精氨酸-C3f

補體系統(tǒng)是廣泛存在于血清、組織液和細(xì)表膜表面的一組精密調(diào)控蛋白，是一個復(fù)雜的先天免疫監(jiān)視系統(tǒng)，是人體免疫防御的第一道防線，在抵御病原體和保持宿主體內(nèi)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。補體系統(tǒng)主要由30多種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白組成，這些蛋白目前被分為三類，包括補體固有成分、多種調(diào)節(jié)因子和補體受體。在這些成分中,補體固有成分的第三組分(C3)是機體補體系統(tǒng)濃度最高的成分，主要由α和β兩條肽鏈經(jīng)二硫鍵連接而成。在補體激活過程中，3條補體激活途徑(包括經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)都需要通過活化的C3形成C5活化酶而進(jìn)一步發(fā)揮級聯(lián)放大作用[1-3]。C3f是在C3b失活過程中，從C3b片段上剪切下來的一個17肽[4]。脫精氨酸-C3f(DRC3f)是C3f在羧基肽酶-N作用下脫精氨酸形成的一個16肽。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn),發(fā)現(xiàn)C3f和DRC3f在多種疾病的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)疾病早期診斷標(biāo)志物和藥物作用靶點等領(lǐng)域具有一定的研究價值[5-7]。因此，本文就補體C3f和DRC3f的結(jié)構(gòu)和功能研究現(xiàn)狀綜述如下，以期對進(jìn)一步研究提供參考。

1研究背景

蛋白質(zhì)組學(xué)是以研究細(xì)胞、組織甚至有機體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為目的的學(xué)科，它是繼基因組學(xué)發(fā)展后的一個新興的研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展應(yīng)運而生，它主要包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)和蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。

蛋白分離技術(shù)就是將目的蛋白從實驗標(biāo)本的大量蛋白中分離出來的技術(shù)，主要分為基于凝膠分離技術(shù)和非凝膠分離技術(shù)。雙向凝膠電泳分離技術(shù)(2-DE)是基于凝膠分離技術(shù)的經(jīng)典方法，被廣泛應(yīng)用；而非凝膠分離技術(shù)的代表技術(shù)就是液相色譜技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，它可以分為一級質(zhì)譜技術(shù)和二級質(zhì)譜技術(shù)。一級質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品經(jīng)不同方式的離子源離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比的差別來確定分子質(zhì)量以待進(jìn)一步鑒定，其代表技術(shù)為基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)。在此技術(shù)中，目的蛋白的鑒定結(jié)果是蛋白質(zhì)荷比，并不能確定其身份，但可用于建立診斷決策樹和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等數(shù)模方式。二級質(zhì)譜技術(shù)是對一級質(zhì)譜技術(shù)鑒定出的目的蛋白進(jìn)行再次離子化的技術(shù)，它可以鑒定出蛋白的氨基酸序列，以便后續(xù)功能研究[8]。

液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是一種將蛋白質(zhì)分離技術(shù)和鑒定技術(shù)結(jié)合起來的新興技術(shù)，它主要基于磁珠分選與MALDI-TOF-MS聯(lián)合應(yīng)用，然后通過二級質(zhì)譜鑒定出蛋白的氨基酸序列而確定蛋白身份。由表面經(jīng)化學(xué)或生物處理的磁珠、磁珠分選儀器及質(zhì)譜檢測系統(tǒng)三部分構(gòu)成。血清、尿液、細(xì)胞抽提物等標(biāo)本無需特殊處理，可直接與磁珠結(jié)合進(jìn)行分選，保存了較好的蛋白完整性。由于此技術(shù)對小分子蛋白檢出率高，是一種上樣量小、高通量、低耗材的自動化技術(shù)，而且重復(fù)性好、具有較高的靈敏度和特異性[9-10]，目前已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。許多不同研究方向的科研工作者，應(yīng)用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對多種疾病進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，均發(fā)現(xiàn)差異蛋白C3f或DRC3f，說明它們在疾病的發(fā)生發(fā)展中普遍參與，因此，具有相當(dāng)?shù)难芯績r值。

2C3f和DRC3f的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜特性

C3f是C3b在失活過程中，從C3b片段上剪切下來的一個17肽，其相對分子質(zhì)量約為2 021,經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列為NH2-Ser-Ser-Lys-Ile-Thr-His-Arg-Ile-His-Trp-Glu-Ser-Ala-Ser-Leu-Leu-Arg-COOH。

DRC3f是C3f在羧基肽酶-N作用下脫去精氨酸，迅速生成的16肽，其相對分子質(zhì)量約為1 866，經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列為NH2-Ser-Ser-Lys-Ile-Thr-His-Arg-Ile-His-Trp-Glu-Ser-Ala-Ser- Leu-Leu-COOH。

3C3f功能的研究現(xiàn)狀

3.1矽肺本課題組應(yīng)用Dynabeads RPC18磁珠與MALDI-TOF-MS聯(lián)合檢測技術(shù)，對30例非矽塵暴露健康體檢者、30例矽塵暴露患者(0期)、30例可疑矽肺患者(0+期)及25例Ⅰ期矽肺患者的血清進(jìn)行檢測，共得到5個差異峰，其中相對分子質(zhì)量5 081和5 066處為表達(dá)上調(diào)的肽段，2 021、3 954、1 777處為表達(dá)下調(diào)的峰。選取比較有意義的2 021和1 777的肽段進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列，結(jié)果兩個肽段身份同為補體C3的一個片段-C3f。后續(xù)用人工合成的C3f體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)，發(fā)現(xiàn)C3f均可以抑制MRC-5細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，從而推斷在矽肺中C3f是通過抑制TGF-β1這一途徑來抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)的[11-13]。

3.2系統(tǒng)性硬化癥Xiang等[7]應(yīng)用疏水相互作用層析18磁珠與MALDI-TOF-MS聯(lián)合檢測，對40例硬皮病患者、30例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者、21例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者、30例骨關(guān)節(jié)炎患者和26名健康獻(xiàn)血者血清標(biāo)本進(jìn)行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)，有一組相對分子質(zhì)量為1 865、1 778、1 691、1 563、1 450的短肽在硬皮病中顯著表達(dá)。經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)這組蛋白是從補體C3b衍生出來的，屬于DRC3f家族。其中DRC3f(相對分子質(zhì)量1 865)與硬皮病中血管受累程度及疾病的活動度皆有關(guān)聯(lián)。然后，他們用人工合成的DRC3f和C3f，以及含DRC3f的濾過血清分別刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DRC3f和C3f可以刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖而對成纖維細(xì)胞的增殖沒有刺激作用。同時，他們還檢測出DRC3f和C3f的刺激均能使血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的量增加。之后，他們又證實DRC3f和C3f能夠提高皮膚成纖維細(xì)胞TGF-β1生成量,且呈劑量依賴性[14]。由此推斷，在硬皮病發(fā)病過程中，DRC3f和C3f可能對皮膚膠原纖維過度沉積起著促進(jìn)作用。

3.3肝病王劍[15]應(yīng)用WCX磁珠與MALDI-TOF-MS聯(lián)合技術(shù)，檢測14例急性乙肝(AHB)、76例慢性乙肝(CHB)、41例肝硬化(LC)和14例原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)患者血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量為1 866的肽段在輕、中度CHB患者血清中濃度較高，而在重度CHB患者血清中濃度較低，表達(dá)差異顯著，然后對其進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定身份為DRC3f。之后，他們用新鮮和超濾過的含有DRC3f的輕、中度CHB患者血清以及人工合成的DRC3f和C3f刺激正常人肝細(xì)胞(QSG-7701)，發(fā)現(xiàn)它們都對肝細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，同時還發(fā)現(xiàn)DRC3f可以降低肝細(xì)胞中TGF-β1及Ⅰ型膠原的表達(dá)。因此，他們推斷DRC3f可能是重度肝炎的生物標(biāo)志物,并且可能參與了CHB感染及其病情進(jìn)展的某種機制[16]。他們還以小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)500 μg/kg地塞米松和800 μg/kgDRC3f在預(yù)防刀豆A引起的急性肝損傷中起到的作用是相當(dāng)?shù)?，由此推斷DRC3f對急性肝損傷有保護(hù)作用[17]。此外,他們還證實，外源性DRC3f可通過TGF-β1通路抑制肝星狀細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA等蛋白的表達(dá)[18]。

Xin等[19]應(yīng)用C18反相色譜柱與MALDI-TOF-MS聯(lián)合技術(shù)，對青島63例診斷為非酒精性脂肪肝(NAFLD)的患者及其正常的雙胞胎同胞的血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)差異蛋白C3f和纖維蛋白肽A。然后他們用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測NAFLD患者血清和健康人血清各50例，發(fā)現(xiàn)C3f和纖維蛋白肽A在兩組間存在顯著差異，并得出結(jié)論C3f和纖維蛋白肽A可能是NAFLD的潛在診斷標(biāo)志物。

3.4其他疾病沈芳芳等[20]利用WCX磁珠的液體芯片飛行時間質(zhì)譜，在糖尿病腎病維持性透析患者透析前、后的血清中也發(fā)現(xiàn)差異蛋白C3f，其在透析前血清中顯著高于透析后血清及透析廢液。

朱德祥等[21]應(yīng)用免疫金屬親和銅離子磁珠的液體芯片飛行時間質(zhì)譜，在結(jié)直腸癌患者血清中也找到了差異蛋白C3f，其在腸癌患者血清中較正常對照組表達(dá)是下調(diào)的。

Wang等[6]利用2-DE的液體芯片飛行時間質(zhì)譜，檢測強肌腱力方(QJF)治療前后的重癥肌無力(MG)患者血清，發(fā)現(xiàn)差異蛋白補體C3f在治療后表達(dá)上調(diào)。

4結(jié)束語

補體C3是人體內(nèi)補體系統(tǒng)中濃度最高的分子，也是補體系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，3條補體激活途徑都需要通過活化的C3形成C5活化酶而進(jìn)一步發(fā)揮級聯(lián)放大作用。C3活化后形成的C3b即為C5活化酶的組成部分，其可在CR1或H因子的幫助下，由H因子分解為iC3b和17肽C3f[4]。有研究表明在C3b失活過程中，前兩步的剪切(也就是C3f和C3dg被剪切出來的過程)可能對C3b的失活具有重要意義[22]，但具體機制尚不清楚。目前，C3f或DRC3f參與補體激活的具體過程和免疫機制也有待發(fā)現(xiàn)。因此，期待相關(guān)科研工作者給予進(jìn)一步研究和成果匯報。

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*基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(30771788)；天津市衛(wèi)生局科技基金項目(06KG10)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃面上項目(06YFJMJC09900)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.028

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1820-03

(收稿日期：2016-03-07修回日期：2016-05-18)

△通訊作者，E-mail:wshx-001@163.com。