應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性

徐羽中，陳群蓉，孫順昌△，彭運(yùn)生

(廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.輸血科　518101)

?

·論著·

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性

徐羽中1，陳群蓉2，孫順昌1△，彭運(yùn)生1

(廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.輸血科518101)

摘要:目的建立實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA序列多態(tài)性的方法。方法以16例Gilbert綜合征患者和66例健康對(duì)照個(gè)體為研究對(duì)象，抽提基因組DNA，通過(guò)DNA測(cè)序確定UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA序列多態(tài)性。同時(shí)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物和2條TaqMan MGB探針，2條探針的5′端分別標(biāo)記FAM和VIC染料，探針的3′端則均以MGB修飾。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法擴(kuò)增并檢測(cè)研究對(duì)象的UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性序列，與測(cè)序法比較，驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度和特異度。結(jié)果應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)，16例Gilbert綜合征患者的UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性序列均為A(TA)7TAA，46例健康對(duì)照個(gè)體A(TA)nTAA多態(tài)性序列為A(TA)6TAA，其余20例健康對(duì)照個(gè)體A(TA)nTAA多態(tài)性序列為A(TA)6TAA/A(TA)7TAA雜合多態(tài)性。上述結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果完全一致。結(jié)論通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA序列多態(tài)性的方法具有靈敏度高、特異度強(qiáng)及操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可在臨床推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞:UGT1A1基因；多態(tài)性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)是催化膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸侨┧崮懠t素的關(guān)鍵酶之一[1]。UGT1A1酶是UGT1A1基因的編碼產(chǎn)物，UGT1A1基因突變會(huì)導(dǎo)致血清膽紅素升高，依據(jù)膽紅素升高程度由低到高分別命名為Gilbert綜合征(20～60 μmol/L)、Ⅰ型Crigler-Najjar綜合征(>60～340 μmol/L)、Ⅱ型Crigler-Najjar綜合征(>340 μmol/L)[2]。Gilbert綜合征是以間歇性非溶血性黃疸為病理特征的良性遺傳性疾病，患者血清膽紅素輕度升高，其臨床表現(xiàn)為長(zhǎng)期間歇性黃疸[3]。在UGT1A1基因啟動(dòng)子中存在A(TA)nTAA微衛(wèi)星多態(tài)性，其中(TA)重復(fù)拷貝數(shù)越多，UGT1A1酶活性越低[4]。A(TA)6TAA和A(TA)7TAA是人群中兩種常見(jiàn)多態(tài)性，非洲人群偶見(jiàn)A(TA)5TAA多態(tài)性，高家索人群偶見(jiàn)A(TA)8TAA多態(tài)性。在中國(guó)人群中僅發(fā)現(xiàn)A(TA)6TAA和A(TA)7TAA兩種多態(tài)性序列[5]。研究發(fā)現(xiàn)A(TA)nTAA多態(tài)性與伊立替康(irinotecan)、阿扎那韋(atazanavir)等藥物的不良反應(yīng)有關(guān)，群體遺傳學(xué)研究還顯示美國(guó)籍非洲人群中A(TA)7TAA多態(tài)性與乳腺癌的易患性存在相關(guān)[6]。因此，UGT1A1基因啟動(dòng)子A(TA)nTAA多態(tài)性檢測(cè)在臨床具有重要的意義。本研究將試圖建立檢測(cè)A(TA)nTAA多態(tài)性的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2009年10月至2013年4月在本院就診的16例Gilbert綜合征患者，其中男9例，女7例，年齡15～46歲。Gilbert綜合征診斷依據(jù)包括臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及基因突變分析。診斷標(biāo)準(zhǔn)為臨床出現(xiàn)間歇性非溶血性黃疸、升高的膽紅素以游離膽紅素為主、排除肝膽疾病、排除溶血因素、檢測(cè)到UGT1A1基因突變。選擇同期健康體檢的66例健康者，其中男36例，女30例，年齡18～56歲。所有研究對(duì)象的UGT1A1基因啟動(dòng)子中A(TA)7TAA多態(tài)性序列通過(guò)PCR擴(kuò)增并測(cè)序確定，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均被告知研究?jī)?nèi)容，并同意參與本研究。研究對(duì)象的基因組DNA為-30 ℃冰箱保存的經(jīng)苯酚-氯仿抽提制備的基因組DNA。

1.2方法

1.2.1儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為L(zhǎng)ightCycler 480Ⅱ擴(kuò)增儀(瑞士羅氏診斷公司制造)。

1.2.2引物及探針設(shè)計(jì)在UGT1A1基因(GenBank NM_000463.2)啟動(dòng)子區(qū)及外顯子1上設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增基因的啟動(dòng)子區(qū)及外顯子1的部分序列。上游引物序列為5′-CAT TAA CTT GGT GTA TCG ATT GGT-3′，下游引物序列為5′-AGC AGG CCC AGG ACA AGT-3′。與A(TA)6TAA序列雜交的探針1序列為FAM-TTG CCA TAT ATA TAT ATA TAA GTA GGA-MGB，與A(TA)7TAA序列雜交的探針2序列為VIC-TGC CAT ATA TAT ATA TAT ATA AGT AGG A-MGB，其中FAM與VIC為熒光染料，探針3′ 端以小溝聚合物(MGB)修飾。引物合成、探針合成及修飾均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為132 bp [A(TA)6TAA]或134 bp[A(TA)7TAA]。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)在96孔反應(yīng)板中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為50 μL 。反應(yīng)體系含75 mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、20 mmol/L (NH4)2SO4、0.01%吐溫20、3.0 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L引物/條、0.2 μmol/L探針/條、0.4 U Taq DNA聚合酶、100 ng基因組DNA。PCR擴(kuò)增程序?yàn)槭紫?5 ℃變性5 min，然后進(jìn)入40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每一循環(huán)包括95 ℃變性15 s，60 ℃雜交1 min，熒光采集模式設(shè)為60 ℃單點(diǎn)采集。結(jié)果分析模式為終點(diǎn)基因分型，X軸為FAM熒光強(qiáng)度，Y軸為VIC熒光強(qiáng)度。

1.2.4方法學(xué)評(píng)價(jià)讀取實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的A(TA)nTAA多態(tài)性結(jié)果，并與以前的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)A(TA)nTAA多態(tài)性的靈敏度和特異度。

2結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能檢測(cè)分型A(TA)nTAA多態(tài)性通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，本研究標(biāo)本全部成功擴(kuò)增。終點(diǎn)基因分型法顯示，16例Gilbert綜合征患者的UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性序列均為A(TA)7TAA，46例健康者A(TA)nTAA多態(tài)性序列為A(TA)6TAA，其余20例健康者A(TA)nTAA多態(tài)性序列為A(TA)6TAA/A(TA)7TAA雜合多態(tài)性序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能分型全部個(gè)體UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)的A(TA)nTAA多態(tài)性序列。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分型A(TA)nTAA多態(tài)性具有高的靈敏度和特異度通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，16例Gilbert綜合征患者和66例健康者UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性序列均被成功檢測(cè)，與測(cè)序一致，檢測(cè)靈敏度達(dá)100%。通過(guò)與測(cè)序結(jié)果比較，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分型檢測(cè)UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA序列多態(tài)性的結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果完全相符，且3種基因型散點(diǎn)圖分布在3個(gè)明顯不同區(qū)域，每一區(qū)域的點(diǎn)較為集中，因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分型檢測(cè)A(TA)nTAA多態(tài)性的特異度達(dá)100%。

3討論

在UGT1A1基因啟動(dòng)子中存在A(TA)nTAA微衛(wèi)星多態(tài)性，基因中TA重復(fù)序列拷貝數(shù)越多，UGT1A1酶活性越低，研究顯示TA重復(fù)序列每增加1個(gè)拷貝，UGT1A1酶活性就降低30%[8]。伊立替康、氟尿嘧啶與亞葉酸聯(lián)合用藥是目前臨床治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、直腸癌的一線藥物，伊立替康在治療過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)骨髓抑制和遲發(fā)性腹瀉等不良反應(yīng)，這些不良反應(yīng)與個(gè)體UGT1A1基因啟動(dòng)子中A(TA)nTAA多態(tài)性存在相關(guān)[9]。研究顯示UGT1A1基因啟動(dòng)子中攜帶(TA)7TAA的個(gè)體比攜帶(TA)6TAA個(gè)體更能耐受阿扎那韋治療導(dǎo)致的黃疸[10]。群體遺傳學(xué)研究顯示在美國(guó)籍非洲人群中，UGT1A1基因啟動(dòng)子中攜帶A(TA)7TAA多態(tài)性序列個(gè)體的乳腺癌易患性增加[11]。因此UGT1A1基因啟動(dòng)子中A(TA)nTAA多態(tài)性檢測(cè)在臨床具有重要意義。

A(TA)nTAA多態(tài)性屬于短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法有單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、變性高效液相色譜等[12]。這些檢測(cè)技術(shù)各有自身的特點(diǎn)，但也存在一些缺陷，如檢出率不高、假陽(yáng)性率高、檢測(cè)通量低、實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高、實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)、檢測(cè)成本高等，因此難以用于臨床檢測(cè)。微衛(wèi)星多態(tài)性檢測(cè)新方法有侵入探針?lè)治龇ê透叻直媛嗜劢馇€分析法。侵入探針?lè)治龇ㄊ且环N等溫的定性或定量檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，但靈敏度較低[13]。高分辨率熔解曲線分析是一種高效穩(wěn)定的PCR檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)便快速，成本低，已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，但它檢測(cè)微衛(wèi)星多態(tài)性分辨率不高[14]。

TaqMan探針技術(shù)已成為一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，特異度強(qiáng)，靈敏度高，既可用于定量分析，又可用于定性檢測(cè)[15]。TaqMan探針技術(shù)檢測(cè)關(guān)鍵在于合成探針及引物，這給檢測(cè)特定位點(diǎn)序列變異、微衛(wèi)星多態(tài)性序列變異帶來(lái)困難。在中國(guó)人群中UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性序列包括A(TA)6TAA和A(TA)7TAA，用TaqMan探針技術(shù)區(qū)分它們需設(shè)計(jì)一對(duì)引物和兩條探針，且探針覆蓋A(TA)nTAA序列。本研究首先設(shè)計(jì)與A(TA)7TAA序列雜交的探針2：5′-TGC CAT ATA TAT ATA TAT ATA AGT AGG A-3′，為了使2條探針的退火基本一致，設(shè)計(jì)與A(TA)6TAA序列雜交的探針1時(shí)，本研究在探針的5′端延伸了一個(gè)T堿基，因此探針1為5′-FAM-TTG CCA TAT ATA TAT ATA TAA GTA GGA-MGB-3′。普通熒光定量PCR TaqMan探針的Tm一般需高于引物的Tm值10 ℃左右，若目標(biāo)區(qū)域(A+T)%含量高，往往達(dá)不到10 ℃左右Tm差值的要求[16]。若延長(zhǎng)探針長(zhǎng)度，又難以區(qū)分A(TA)6TAA和A(TA)7TAA序列，3′ 端標(biāo)記MGB可提高探針的Tm值，故本研究的探針3′ 端以MGB標(biāo)記。兩條探針的5′ 端依據(jù)一般實(shí)進(jìn)熒光定量PCR儀激發(fā)波長(zhǎng)范圍分別標(biāo)記熒光染料FAM與VIC。本研究關(guān)鍵在于成功設(shè)計(jì)了擴(kuò)增UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A(TA)nTAA多態(tài)性序列的探針及引物，并在探針3′端使用MGB修飾，使探針尤其適合檢測(cè)富含AT重復(fù)序列。目前臨床檢測(cè)病原性微生物的基因擴(kuò)增技術(shù)基本都采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，并且同一廠家的大多數(shù)試劑盒共用一個(gè)檢測(cè)程序，極大簡(jiǎn)化了臨床檢測(cè)。本研究使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)A(TA)nTAA多態(tài)性，可與病原性微生物基因檢測(cè)同步進(jìn)行，檢測(cè)方便，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]Sato H，Uchida T，Toyota K，et al.Association of neonatal hyperbilirubinemia in breast-fed infants with UGT1A1 or SLCOs polymorphisms[J].J Hum Genet,2015,60(1):35-40.

[2]Horsfall LJ，Hardy R，Wong A，et al.Genetic variation underlying common hereditary hyperbilirubinaemia (Gilbert′s syndrome) and respiratory health in the 1946 British birth cohort[J].J Hepatol，2014，61(6)：1344-1351.

[3]Chen Z，Su D，Ai L，et al.UGT1A1 sequence variants associated with risk of adult hyperbilirubinemia：a quantitative analysis[J].Gene，2014，552(1)：32-38.

[4]Kim KP，Hong YS，Lee JL，et al.A phase I study of UGT1A1 *28/*6 genotype-directed dosing of irinotecan (CPT-11) in Korean patients with metastatic colorectal cancer receiving FOLFIRI[J].Oncology，2015，88(3)：164-172.

[5]Hsieh TY，Shiu TY，Chu NF，et al.Rapid molecular diagnosis of the Gilbert′s syndrome-associated exon 1 mutation within the UGT1A1 gene[J].Genet Mol Res，2014，13(1)：670-679.

[6]Ehmer U，Kalthoff S，F(xiàn)akundiny B，et al.Gilbert syndrome redefined：a complex genetic haplotype influences the regulation of glucuronidation[J].Hepatology，2012，55(6)：1912-1921.

[7]孫順昌，周指明，陳群蓉，等．未結(jié)合型高膽紅素血癥患者UGT1A1基因的突變分析[J]．中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2013，30(4)：425-428．

[8]Warang P，Devendra R，D′silva S，et al.Do UGT1A1 and HMOX1 gene promoter polymorphisms increase the risk of hyperbilirubinemia and gallstones in patients with hereditary spherocytosis[J].Ann Hematol，2015，94(1)：169-171.

[9]Yamasaki S，Tanimoto K，Kohno K，et al.UGT1A1 *6 polymorphism predicts outcome in elderly patients with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma treated with carboplatin，dexamethasone，etoposide and irinotecan[J].Ann Hematol，2015，94(1)：65-69.

[10]Zhang X，Ao G，Wang Y，et al.Genetic variants and haplotypes of the UGT1A9，1A7 and 1A1 genes in Chinese Han[J].Genet Mol Biol，2012，35(2)：428-434.

[11]Travan L，Lega S，Crovella S，et al.Severe neonatal hyperbilirubinemia and UGT1A1 promoter polymorphism[J].J Pediatr，2014，165(1)：42-45.

[12]Kutanan W，Kitpipit T，Phetpeng S，et al.Forensic STR loci reveal common genetic ancestry of the Thai-Malay Muslims and Thai Buddhists in the deep Southern region of Thailand[J].J Hum Genet，2014，59(12)：675-681.

[13]Faltin B，Zengerle R，Von Stetten F.Current methods for fluorescence-based Universal sequence-dependent detection of nucleic acids in homogenous assays and clinical applications[J].Clin Chem，2013，59(11)：1567-1582.

[14]Minucci A，Mello E，Tripodi D，et al.High resolution melting analysis (HRMA) for the identification of a rare UGT1A1 promoter polymorphism[J].Clin Biochem，2011，44(16)：1359-1360.

[15]Mo QH，Wang HB，Tan H，et al.Comparative detection of rotavirus RNA by conventional RT-PCR，TaqMan RT-PCR and real-time nucleic acid sequence-based amplification[J].J Virol Methods，2015，213(1)：1-4.

[16]Mingxiao M，Jinhua L，Yingjin S，et al.TaqMan MGB probe fluorescence real-time quantitative PCR for rapid detection of Chinese Sacbrood virus[J].PloS one，2013，8(2)：e52670.

作者簡(jiǎn)介：徐羽中，女，主管技師，主要從事分子診斷研究。 △通訊作者，E-mail：shunchangsun@aliyun.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.023

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)13-1806-03

(收稿日期：2016-01-27修回日期：2016-04-08)

Analysis on A(TA)nTAA polymorphism of UGT1A1 gene promoter by fluorescence real-time quantitative PCR

XUYuzhong1,CHENQunrong2，SUNShunchang1△，PENGYunsheng1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofBloodTransfusion,BaoanDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518101，China.)

Abstract:ObjectiveTo develop a new method to detect A(TA)nTAA polymorphism in the UGT1A1 gene promoter by fluorescence real-time quantitative PCR (RQ-PCR).MethodsGenomic DNA was extracted from peripheral blood in 16 patients with Gilbert′s syndrome and 66 healthy individuals.The polymorphic A(TA)nTAA sequence in the UGT1A1 gene promoter was determined by DNA sequencing.A pair of primers and two TaqMan probes labeled with either 5′ FAM or VIC reporter dye incorporated a 3′ minor groove binder were designed.The A(TA)nTAA polymorphisms in the UGT1A1 gene promoter were identified by RQ-PCR for all research subjects.The sensitivity and specificity of RQ-PCR for detecting the A(TA)nTAA polymorphisms were verified by DNA sequencing method.ResultsThe homozygous A(TA)7TAA polymorphism was found in the promoter region of the UGT1A1 gene in all 16 patients with Gilbert′s syndrome by using RQ-PCR.The homozygous A(TA)6TAA polymorphism was found in 46 healthy subjects,while the heterozygous A(TA)6TAA/A(TA)7TAA polymorphism was found in other 20 healthy subjects.All A(TA)nTAA polymorphisms in the promoter region of the UGT1A1 gene identified by RQ-PCR were consistent with that of DNA sequencing.ConclusionIt is a sensitive,specific and simple method to detect the A(TA)nTAA polymorphisms in the promoter region of the UGT1A1 gene by RQ-PCR,which can be promoted and applied in clinic.

Key words:UGT1A1 gene;polymorphism;fluorescence real-time quantitative PCR