家貓線粒體DNA的研究進展

雷曉雨 中國刑事警察學(xué)院 110854

谷黨恩 廣東省廣州市公安局花都區(qū)分局刑警大隊技術(shù)中隊 510800

魏文宇 浙江省臺州市公安局黃巖分局 318000

寧　雪 中國刑事警察學(xué)院 110854

家貓線粒體DNA的研究進展

雷曉雨 中國刑事警察學(xué)院 110854

谷黨恩 廣東省廣州市公安局花都區(qū)分局刑警大隊技術(shù)中隊 510800

魏文宇 浙江省臺州市公安局黃巖分局 318000

寧雪 中國刑事警察學(xué)院 110854

隨著生活水平的提高，越來越多的人開始在家里飼養(yǎng)寵物，尤以寵物狗為多。近些年有好多家庭開始養(yǎng)貓。關(guān)于寵物狗的研究已有很多，但是關(guān)于貓的研究卻很少。在我們?nèi)粘Ｉ钪?，貓是人類的朋友之一，貓與我們的生活息息相關(guān)，近來與貓有關(guān)的糾紛及案件越來越多。家貓線粒體DNA（mtDNA）是細胞核外的遺傳物質(zhì)，蘊藏著大量的生物信息，本文將對家貓的mtDNA進行闡述。

法醫(yī)物證學(xué)；線粒體DNA；家貓

1　家貓與法庭科學(xué)

一項來自于美國寵物產(chǎn)品制造協(xié)會的研究報道稱［1］，59.5％的美國人至少擁有一只寵物貓或者寵物狗。美國獸醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)會報道，從2001年到2006年擁有寵物的家庭由61.1萬增加到68.7萬，增加了12.4％。關(guān)于成年寵物貓毛發(fā)增長的研究顯示，平均每年每千克生長32.7g，粗略看來，一個有15磅家貓（6.8kg）存在的家庭每年產(chǎn)毛量為223g，這也暗示了在一個養(yǎng)貓的家庭中有成千上萬的貓毛存在。一項模擬獸毛轉(zhuǎn)移的犯罪現(xiàn)場調(diào)查得出結(jié)論，進入一個養(yǎng)家畜的家庭幾乎不可能不被他們的毛發(fā)污染。倘若涉事當(dāng)事人一方或者雙方為寵物擁有者或者犯罪現(xiàn)場就在寵物居住地，在受害人或者犯罪嫌疑人之間轉(zhuǎn)移寵物毛發(fā)就有很大的可能性。

基于DNA測試的進步，收集到的與犯罪現(xiàn)場有關(guān)系的動物毛發(fā)的證據(jù)價值越來越重要［2］?，F(xiàn)如今，通過一根頭發(fā)去識別一個個體是可行的，只需要提供一根有毛囊或者只剩下毛囊的檢材就可以有效地獲得細胞核DNA去進行認定。個體識別的標準是Short tandem repeat（STR）。研究表明，從50％帶毛囊的貓毛發(fā)中可以獲得STR基因分型。然而，除了毛發(fā)粗細不均之外，不是所有毛發(fā)都包含毛根，沒有毛囊就沒法產(chǎn)生細胞核DNA。法醫(yī)生活環(huán)境調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大約95％的毛發(fā)處于最后的生長階段，即毛發(fā)的靜止期，靜止期的毛發(fā)不包含毛囊。因此，在痕量證據(jù)中線粒體DNA含量豐富，可能對于遺傳分析來說是唯一可獲得的資源。

盡管沒有直接的研究統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)證明脫落的貓毛發(fā)依然有毛囊存在，眾所周知家貓對梳洗打扮要求又極其苛刻。脫落的貓毛發(fā)，沒有毛囊，也可能含有足夠的上皮細胞DNA可以用來作mini-STRs、mtDNA或者其他DNA遺傳標記的檢驗。例如，在有貓毛出現(xiàn)作為證據(jù)的情況下，當(dāng)STR分析失敗，貓毛線粒體DNA序列分析可以作為一種包含或者排除的工具，已經(jīng)成功在至少一個刑事犯罪現(xiàn)場調(diào)查或者涉及殺人犯的案件中起到作用。在2003年美國愛荷華州本·奧唐納的案例中，通過對幾個家貓線粒體DNA的檢測，測試結(jié)果被作為佐證給主要嫌疑犯定了二級謀殺罪［3］。

2　家貓線粒體DNA

家貓線粒體全基因組序列長17009bp，已被測序證實其序列符合哺乳類動物線粒體DNA的主要特征。除NADH脫氫酶（ND2）起始密碼子ATC（non-AUG）基因外，密碼子使用和堿基組成也繼承了規(guī)范的脊椎動物模式。家貓線粒體DNA控制區(qū)橫跨大約1560bp，包含兩個明顯的重復(fù)序列置于高度保守的核心序列的兩側(cè)。

脊椎動物線粒體基因主要編碼氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)移的主要成分，許多無脊椎動物的細胞也有簡單的雙鏈環(huán)狀線粒體基因組。絕大多數(shù)哺乳類動物，線粒體基因組包含13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個tRNA基因和2個rRNA基因，雖然從后獸亞綱分離出來，但是保留了基本的基因組織形式。在非編碼的控制區(qū)有很多畸變，D-1oop管理轉(zhuǎn)錄，復(fù)制主要在線粒體DNA的編碼區(qū)。線粒體DNA的序列和長度偏差主要表現(xiàn)在控制區(qū)。

（1）貓的細胞質(zhì)線粒體DNA組成部分。貓的線粒體DNA是由13個結(jié)構(gòu)性開放性閱讀框（ORFs）、22個tRNA基因、2個rRNA基因和1個控制區(qū)組成。家貓線粒體DNA序列包含幾個在其他哺乳類動物均有的特征。第一，所有的開放性閱讀框的方向和其他同源的哺乳動物的開放性閱讀框相同，沒有重新排列。第二，ND1、ND2、COIII，、ND3、ND4基因缺少完整的終止密碼子，然而，完整的終止密碼子可能讀到tRNA基因下游就直接終止了ND1和ND2。根據(jù)人類的模型冒昧地認為貓的線粒體轉(zhuǎn)錄是聚腺苷酸化，絕大多數(shù)貓的線粒體終止密碼子是TAA。第三，無視開放性閱讀框終止密碼子下游的tRNA基因（比如ND1和ND2），在ATPase 8和ATPase 6、ND4、ND4L、ND5和ND6基因編碼序列部分重疊。第四，家貓輕鏈復(fù)制起始點（ORL）的d（C-G）比麻斑海豹少，麻斑海豹復(fù)制起始點d（C-G）含量豐富，占53％，但是家貓復(fù)制起始點（ORL）有一個穩(wěn)定的莖環(huán)（stem-1oop）結(jié)構(gòu)。2個rRNA基因及主要的結(jié)構(gòu)基因和其他相關(guān)哺乳類動物線粒體DNA相比沒有明顯長度差異。

家貓線粒體DNA由32.5％A、26.2％C、14.2％ G和27.1％T組成。類似于麻斑海豹的線粒體DNA，家貓線粒體DNA在哺乳動物間含有更高的dG，但是在家貓線粒體DNA結(jié)構(gòu)基因第三密碼子區(qū)域?qū)G有強烈的偏差。除了I1e和Phe密碼子外，家貓線粒體DNA密碼子選擇的模式和其他哺乳動物線粒體DNA選擇偏好一樣。與麻斑海豹密碼子選擇相比，家貓線粒體DNA多了一個TTT，可能以損害TTC密碼子為代價。另外，家貓ND2啟動基因不是AUG密碼子，而是ATC（I1e），這個結(jié)果也在老鼠和馬的ND3和ND5基因觀察到［4］。與其他哺乳動物基因形成對照，ATPase 8基因在3，通過復(fù)制一個Q residue，形成的原因可能是在DNA復(fù)制過程中的滑移。最后，在線粒體DNA基因中共有34bp組成了未翻譯的間隔核苷酸。

（2）家貓tRNA基因分析。家貓線粒體DNA中tRNA和其他脊椎動物一樣，是典型的二級結(jié)構(gòu)分子，比如說反密碼子（AC）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、T-F-C臂和氨基酸臂（A-A），這些結(jié)構(gòu)在許多家貓線粒體tRNAs中可以觀察到。與牛和麻斑海豹tRNA序列相比較，絕大部分不同發(fā)生在T-F-C臂、二氫尿嘧啶核苷環(huán)或者位于AC莖環(huán)和T-F-C臂之間的被稱為“易變”環(huán)的區(qū)域。在His、G1n、Phe、Pro、Tyr、Leu和Asp tRNAs基因二氫尿嘧啶核苷環(huán)發(fā)生的插入和缺失突變與?？苿游锞€粒體DNA基因不同。比如，家貓tRNA-Phe基因比牛科動物長3bp。在所有動物的比較中，tRNA的AC環(huán)區(qū)域比較保守。此外，家貓tRNA-Leu（CUN）基因比麻斑海豹長，這就更好地解釋了ND5 5，邊界不清，導(dǎo)致它的序列比其他哺乳動物長3個殘基（M-K-V）。盡管有補償機制，但是與?？苿游锞€粒體DNA相比，家貓A1a、Va1和Met tRNA序列在AC莖環(huán)包含大量的突變。

（3）家貓線粒體DNA控制區(qū)。家貓線粒體DNA橫跨大約1560 bp。家貓線粒體DNA控制區(qū)（CR）有一個與眾不同的特征，在控制區(qū)高度保守的核心序列兩邊分別有一個重復(fù)序列（RS2和RS3），他們一起使家貓線粒體控制區(qū)比人類多了447 bp。這樣的重復(fù)序列的位置使家貓和其他哺乳動物相比控制區(qū)更為保守。RS3，位于家貓線粒體輕鏈3，端（開始于nt pos.270），長度為294bp，含有大量的d（C-A）重復(fù)［24］，同其他食肉動物一樣，類似于核微衛(wèi)星［5］。RS3包含一個6-到8-bp核心單元，ACACACGT，不完全重復(fù)37次。RS2位于控制區(qū)輕鏈5，端，包含3個完整的80-到82-bp單體（a–c），他們之間互相高度保守，相似性為91％～98％。家貓RS2基因序列和它同源的蝙蝠和鼩鼱科有67％～74％的相似性。家貓在它自己的3，RS2c序列顯示出最大的分歧，然而它5，在縮短后只有34bp，重復(fù)單位（pos.16504）和其他種類比有94％的相似性和一個缺失。家貓RS2包含幾個回文序列（5，TACAT-ATGTA 3，），該回文序列開始位置在pos.16507，可能來源于二級結(jié)構(gòu)，也可能是在D-1oop復(fù)制中起末端序列關(guān)聯(lián)（TAS）作用［5］。和一個重復(fù)單位相比，大批量的或者2到3個二級結(jié)構(gòu)的RS2重復(fù)會更穩(wěn)定。

3　家貓線粒體研究現(xiàn)狀

脫落的家貓毛發(fā)是一種極好的痕量證據(jù)，盡管它的分析價值既沒有鑒別也沒有全容量的開發(fā)出來。2011年Christy R.Tarditi等人為了法醫(yī)學(xué)應(yīng)用檢測家貓線粒體DNA控制區(qū)。選用美國四個州的174只家貓，對線粒體DNA控制區(qū)402bp進行測序，選定的區(qū)域排除了兩端有問題的串聯(lián)重復(fù)序列。結(jié)果在所有選取的個體中都出現(xiàn)了4種常見的線粒體單倍型，異質(zhì)性為1.7％。在18只家貓中出現(xiàn)獨特的線粒體單倍型，占研究總體的10.3％。在個體識別方面顯示，每10只隨機選取的家貓有8.3只可以通過該區(qū)域測序達到排除。該區(qū)域的遺傳特征和產(chǎn)生的數(shù)據(jù)庫支持法醫(yī)學(xué)應(yīng)用［6］。

4　展望

隨著全世界對家貓研究的日益重視，很多國家在法庭科學(xué)上應(yīng)用了家貓作為證據(jù)，同時對于家貓線粒體DNA的深入研究也在進行中。目前，家貓的地理分布較為廣泛，有良好的遺傳多態(tài)性，而家貓的mtDNA單倍型跟種屬之間的關(guān)系比較復(fù)雜，但隨著研究的深入，更多的mtDNA單倍型被發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)樹進一步細化。同時結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，通過對相關(guān)生物檢材mtDNA等遺傳物質(zhì)的檢測，推測犯罪現(xiàn)場遺留下的生物檢測的相關(guān)信息，可為偵查提供方向。

［1］American Pet Product Manufacturing Association（APPMA）. National pet owner's survey.Greenwich，CT：APPMA，2006.［2］Higuchi R，von Beroldingen CH，Sensabaugh GF，Erlich HA. DNA typing from single hairs.Nature 1988；332（6164）：543-6.

［3］Halverson JL，Lyons LA.Forensic DNA identification of feline hairs：casework and a mitochondrial database.Proc Am Acad Forensic Sci 2004；X：B150.

［4］Arnason，U.，Gullberg，A.，Johnsson，E.，andLedje，C.（1993）.The nucleotide sequence of the mitochondrial DNA molecule of the grey seal，Halichoerus grypus，and comparison with mitochondrial sequences of other true seals.J.Mol.Evol. 37：323–330.

［5］Hoelzel，A.R.，Lopez，J.V.，Dover，G.A.，and O'Brien，S.J.（1994）.Rapid evolution of a heteroplasmic repetitive sequenceinthemitochondrialDNAcontrolregionofcarnivores.J.Mol.Evol.39：191–199.

［6］Christy R.Tarditi，B.S.；Robert A.Grahn，Ph.D.；Jeffrey J. Evans，B.S.；Jennifer D.Kurushima，B.S.；and Leslie A.Lyons，Ph. D.MitochondrialDNASequencingofCatHair：An Informative Forensic Tool.J Forensic Sci，January 2011，Vol. 56，No.S1 doi：10.1111/j.1556-4029.2010.01592.x.